二抗选择指南

二抗选择指南

二抗是结合与一抗的抗体。在多种免疫检测实验(例如免疫荧光IF,免疫组化IHC,ELISA, WB等)中,二抗经常和一抗结合使用以检测目标蛋白。很多二抗都带有标记物,如各种荧光染料或辣根过氧化物酶(HRP)/Biotin,从而使二抗的信号可以被检测到。

使用二抗有很多优点,因为当一抗的种属相同时,不论一抗是针对何种靶标,都可以使用相同的二抗,且二抗更换不同的标记物后能适应不同的免疫检测实验。另外,二抗结合在抗原位置的标记染料比直标一抗要多,从而增强检测信号。且可避免对一抗进行化学标记(偶联),实验选择更灵活。

选择最合适的二抗主要需考虑以下因素:

  • 确定一抗的宿主物种(例如,小鼠抗微管蛋白、兔抗 CD4)
  • 选择适当的二抗宿主物种(山羊抗小鼠 IgG、驴抗兔 IgG)
  • 考虑二抗的交叉反应性或特异性问题
  • 标记物类型:和适合的酶、标签或荧光基团偶联以用于所选择的检测方法
  • Buffer状态成分:无菌液体或冻干、含PBS或Tris缓冲液、含载体蛋白或添防腐剂等

详述如下:

1. 二抗种属来源和种属反应性

种属来源是指制备这种二抗的物种,种属反应性是指针对的一抗的物种。当然,二抗也是一个相对性的概念。例如,使用小鼠IgG免疫山羊时,获得的抗体是山羊抗小鼠IgG二抗,继续使用山羊IgG免疫兔子,获得的抗体是兔抗山羊IgG二抗(在具体的免疫检测实验中,其相当于三抗),我们提供的二抗种属来源包括驴、山羊、小鼠、兔等。

注意1:所用二抗的种属来源必须不同于一抗的种属来源和反应种属。例如,如果一种一抗来源于兔,则不能使用来源于兔的二抗。

注意2:当描述抗鼠抗体时,尽可能使用具体的物种,即抗大鼠二抗、抗小鼠二抗、抗仓鼠二抗等。

注意3:种属反应性除了需要关注一抗的来源,有时也需要关注所使用的样本来源。

大多数一抗是在小鼠或兔的体内制备的。抗小鼠IgG和抗兔IgG二抗是最畅销的类型。山羊是最容易且最常被制造商选用的二抗种属来源,用来制备多克隆抗小鼠和抗兔的二抗。市面上也有一些来源于其它物种的抗小鼠和抗兔二抗,不同物种来源的二抗具有不同的抗体亲和力、检测灵敏度或交叉反应特性(抗体特异性)。例如,同等纯化条件下,驴抗通常具有较低的交叉反应性或较高的检测灵敏度或更高的特异性。

二抗种属来源示意图
2. 特异性反应

确保二抗可以检测相应的目标一抗。反应性不仅包括目标物种,还包括目标免疫球蛋白(Ig)的类型和亚型,如抗小鼠IgG(H+L)指二抗可以和所有的小鼠IgG结合(因某些物种的IgG 的同源关系较近,通常也会和其他物种的IgG有一定程度的交叉反应),而抗小鼠IgG1则此二抗的特异性相对更高一些(只和小鼠IgG的亚型IgG1结合),抗小鼠IgG F(ab’)2则此二抗只和小鼠IgG抗体的F(ab’)2片段结合。

确定所需目标物种的方法通常简单直接,它指的是一抗的种属来源。如果使用的是兔源多克隆一抗,则需要使用抗兔二抗。如果想要检测小鼠源抗体,则需要使用抗小鼠二抗。我们提供针对10种以上不同目标物种的二抗。

3. 纯化方法

大多数二抗从经过免疫的动物血清纯化获得。通常二抗的纯化方法有亲和纯化(抗原亲和纯化,Protein G亲和纯化等),辛酸-硫酸铵纯化,分子筛纯化等。每种纯化方式对于抗体的纯度、纯化效率、纯化得率、纯化抗体的特异、纯化抗体的活性有不同程度影响。亲和层析纯化的抗体一般更受人们欢迎,因为这些产品的特异性较高,产生的非特异性条带和背景较低。

亲和纯化是指将含有抗体的血清通过固相配体的多孔纯化树脂柱。亲和配体会与抗体互相结合,之后血清中其他未结合的成分可经过漂洗步骤去除,最后使用一种可破坏配体-抗体相互作用的缓冲液将抗体从树脂柱上洗脱并回收(即纯化抗体)。这种类型的纯化方法是通过使用可识别抗体的配体(如蛋白G)或可被抗体识别的配体(如目标抗原)来实现的。

4. 交叉吸附

交叉吸附相当于另一种纯化二抗的方式,因为二抗通常是多抗,存在多种抗体亚型的混合,因此会存在交叉反应现象。例如某些羊抗小鼠IgG二抗可能会和兔源一抗存在一定程度的结合,对二抗进行交叉吸附纯化可以较好的去除来源于非目标抗体和蛋白的交叉反应性,从而提高抗体的特异性。

交叉吸附是指将亲和纯化的二抗通过一个固定有其它种属来源的抗体或血清蛋白的纯化柱。能够识别这些其它种属来源的抗体或血清蛋白的二抗将结合在纯化柱上从而被去除,通过这种方法可以获得交叉反应性更低的二抗,从而降低背景和提升抗体效价,交叉吸附的二抗通常用于多个靶标同时检测的场景,以便获得更好的测试效果。

5. 多重检测能力

对于很多抗体检测应用而言,进行多重检测的实验样本能提供更多的测试信息、提高样本利用率、获得更准确的多个靶标蛋白相互作用的数据。多重检测是指使用不同的荧光染料同时检测多种目标蛋白。

高度交叉吸附纯化的抗体降低了物种间交叉反应性和背景信号,可以很好的实现多重检测。选择标记物时需要注意选择发射光谱不重叠的标记物。

6. 抗体类型和亚型

抗体有多种类型,每种类型的抗体发挥特定的功能。我们目前提供针对IgG、IgM、IgY类型的二抗。IgG抗体可进一步根据氨基酸组成的不同分为不同亚型如IgG2a、IgG2b等。选择二抗很重要的一点是选择特异性针对所用一抗类型或亚型的二抗。当使用的是单克隆一抗时这一点尤为重要,因为根据定义,每种单克隆抗体仅属于一种抗体亚型。

单克隆抗体的类别及亚型通常会在产品列表中列出,如果你的一抗是小鼠IgM,那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgM。如果单克隆一抗是小鼠IgG的某一亚型(IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG3),那么几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合,或者你也可以选择专门针对这一亚型的二抗,例如,如果你的一抗是小鼠IgG1,那么你可以选择抗IgG1的二抗,此种抗体在双标记实验中尤其适合。如果你不知道一抗是哪一类别或亚型,那么抗小鼠IgG是一个不错的选择,因为此种抗体可以识别大多数类型的IgG免疫球蛋白。

对于二抗的类型或亚型,讨论较少,这主要是因为二抗大多是IgG类型的多抗,且二抗亚型对于免疫检测结果相关性不大,因此当我们说羊抗小鼠IgG(H+L)二抗时,往往省略了此二抗的亚型。但是在某些特殊应用时,需要明确二抗具体的类型,此时可询问厂家或仔细阅读说明书,获知详情。我们提供的二抗不但包括多种属多抗类型,也包括小鼠源单抗类型,小鼠源单抗类型主要是IgG, 具有不同亚型(IgG1,IgG2a等),可满足用户不同需求(例如需要使用到"三抗"的场合)。

7. 完整抗体/抗体片段

二抗分为完整抗体形式和抗体片段形式。使用完整抗体还是抗体片段通常取决于所进行的应用。例如,抗体片段对于免疫组织化学和免疫荧光是最佳选择,因为它们的分子量较小并易于穿透组织。但同时抗体片段形式的二抗成本较高,在大多数应用中,完整抗体是最常用的二抗类型。

完整的抗体包括重链和轻链,通过可变区提供二价结合能力,同时具有可偶联产生信号的染料或酶标记物的的恒定区。但是,因为轻链的结构相似性,完整抗体可能会导致背景信号产生或特异性降低。

F(ab')2片段是通过对完整抗体使用胃蛋白酶进行酶解后获得的。这种抗体片段包含带有两个抗原结合位点的可变区,但缺少抗体的Fc片段。因此,F(ab')2片段对于可能含有Fc受体的样本而言是应当优先选择的二抗类型。同时它们比完整抗体要小,因此穿透某些样本的效果更好。但是,分子较小也意味着可以同F(ab')2片段偶联的染料和酶也更少,从而使得这类二抗的灵敏度不及完整抗体形式的二抗。Fab'片段是通过对完整抗体使用木瓜蛋白酶进行酶解后获得的。这类抗体片段包含一个单独的结合结构域,同时带有一小部分恒定区。Fab'片段可以用于不适合使用二价抗体的一些特定应用。

抗体结构示意图
8. 标记物类型

标记物的选择取决于所进行的实验应用以及如何检测二抗(和检测仪器设备、检测体系相关)。例如,选择高亮度和光稳定性的Fluor荧光染料进行细胞成像实验或流式实验,需要配备适合检测该荧光染料的荧光显微镜(滤光片,检测通道),选择使用高活性HRP标记的二抗进行免疫组织化学或免疫印迹实验,需要配备DAB显色系统或者ECL检测系统。每一种标记物具有不同的适配体系及物理化学性质。详情参见荧光染料或标记物特征介绍。

Fluor系列标记物:Fluor染料作为二抗标记物具有卓越的光强度和光稳定性,性能通常优于传统的荧光二抗。

Fluor串联标记物:我们提供多种用于流式细胞技术的链霉亲和素-藻红蛋白(RPE)和别藻蓝蛋白(APC)与Fluor染料的串联标记物。RPE的Fluor标记物比传统的RPE荧光染料信号更强,可获得更高的检测灵敏度,捕获丰度更低的细胞信号。

经典荧光标记物:荧光素 (FITC)、四甲基若丹明 (TRITC)、Cy3、Cy5以及Texas Red™等经典荧光染料,现在都可使用Fluor染料进行替代,以获得更好的光强度和光稳定性。但是,我们仍然提供部分上述标记物偶联的二抗以方便用户重复以前的实验(后续将逐步替换,若用户有其他经典荧光标记物需求,我们也可以提供定制)。

经典荧光串联标记物:大多数早期的串联染料,如RPE-Texas Red染料,RPE-Cy5,以及RPE-Cy5.5,现在很多都可使用Fluor染料进行替代,以获得更好的性能。这些标记物我们目前可以提供定制标记二抗 。

R-Phycoerythrin:我们提供R-藻红蛋白偶联的二抗。R-藻红蛋白 (RPE)具有极高的荧光强度和量子产出。这些基于大分子蛋白的荧光分子主要用于流式细胞检测、基因芯片、ELISA,以及其它需要高灵敏度而非光稳定性的应用。

酶标记物:我们提供高活性的辣根过氧化酶(HRP)标记的WB二抗(碱性磷酸酶AP标记的二抗可接受定制),还可用于ELISA、免疫组织化学或其它酶催化的应用。酶标记物需要与能显色、产生荧光或进行化学发光的底物结合使用以获取可检测的信号。

生物素标记物:我们提供多种生物素标记物。生物素是一个小分子,一种半抗原,可以和亲和素、链霉亲和素蛋白结合。使用生物素标记的二抗使研究者可以在多个应用中使用相同的二抗,只需改变所用的链霉亲和素标记物即可。使用生物素/链霉亲和素体系还可以提高信号。一个荧光二抗通常有2~8个染料分子与其偶联,而在生物素/链霉亲和素体系中,二抗可能含有2~8个生物素分子,每个生物素和1个链霉亲和素分子结合,而每个链霉亲和素含有2~5分子染料,因此生物素/链霉亲和素体系可以较大提高检测信号。但是,内源生物素可能会在富含生物素的样本中造成高背景,它并非是每种应用的最佳体系。

未标记二抗:除了多种标记二抗,我们也提供未标记的二抗。这些二抗与标记二抗品质同样可靠。

亲和素/链霉亲和素

对于将一抗使用生物素标签标记的应用,生物素结合蛋白(即亲和素/链霉亲和素或抗生物素抗体)成为合适的检测试剂。亲和素和链霉亲和素都可与生物素高强度结合,这使得同一种检测试剂可以用于检测多种一抗而不考虑其宿主物种。除了抗体,很多其它蛋白也可使用生物素标记并作为一级探针,用亲和素或链霉亲和素作为二级探针与其一起使用。如果某种一抗市场上没有使用生物素标记的形式,那么可以使用我们的生物素标记试剂盒(SKU:RE80002)对其进行标记。

Hansun 

Hansun是EnkiLife的蛋白标记专家,精通免疫学、各种标记技术和流式检测,致力于蛋白的精准标记,赋能科技突破。每一个蛋白,都值得被“看见”。


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