技术介绍

基因敲除细胞的构建已经从早期的同源重组、ZFN、TALEN 发展到如今的 CRISPR/Cas 系统及其衍生的 Base/Prime Editing，敲除效率显著提升。

恩玑采用 CRISPR/Cas9 体系进行基因敲除细胞系的构建，CRISPR/Cas9 体系由 Cas9 核酸酶 与 向导 RNA（gRNA） 组成。gRNA 通过序列特异性识别基因组中的目标位点，并把 Cas9 蛋白带到目标位点，Cas9 蛋白的核酸酶在特定位点（PAM 序列附近）产生双链断裂（DSB），细胞随后通过 非同源末端连接（NHEJ） 修复断裂，由于末端修复处理不精准，常导致碱基的插入/缺失（indel），从而产生移码或终止密码子，实现基因敲除。若提供同源供体模板，还可通过 同源定向修复（HDR） 实现精准缺失或插入。

运用 CRISPR 技术，需要将 Cas9 蛋白和 sgRNA 递送到目标细胞，根据不同的细胞，可以选择不同的递送方式和方法，目前主要有三种递送形式：

• 质粒/病毒形式：采用分别表达 sgRNA 和 Cas9 的 DNA 质粒（或 sgRNA 和 Cas9 共表达质粒）以质粒的形式或者包装成病毒转染细胞，在细胞内表达 gRNA 和 Cas9 蛋白，进而行使编辑功能。
• 核糖核蛋白复合体瞬转（RNP）：将纯化的 Cas9 蛋白和合成的 sgRNA 混合，二者可以结合形成核糖核蛋白（ribonucleoprotein, RNP）复合体，然后通过瞬时转染技术将 RNP 复合递送到细胞内，进而行使编辑功能。
• RNA 瞬转：体外合成 sgRNA 片段，和表达 Cas9 蛋白的 mRNA 片段，通过瞬时转染技术将两者递送至细胞内，在细胞内表达 gRNA 和 Cas9 蛋白，进而行使编辑功能。

实验原理图

技术应用

基因敲除细胞系是现代分子生物学与药物研发的核心工具，其应用已覆盖 基因功能研究、疾病模型、药物靶点验证、抗体质量控制以及细胞工艺优化 等多个关键领域，为基础科学以及药物研发提供了强有力的技术支撑：

• 基因功能与信号通路解析：通过敲除特定基因，观察细胞增殖、凋亡、分化等表型，阐明基因在生物学过程中的作用；
• 药物靶点验证与筛选：KO 细胞可作为抗体特异性验证的金标准，帮助排除非特异性信号；
• 生物制药与细胞工艺优化：敲除 CHO 细胞中的糖基化相关基因，可以提升重组蛋白的质量与产量，支撑抗体生产。

服务流程

交付标准

• 构建好的细胞株一瓶或者2支冻存株（包含空载对照）
• 电子版构建报告（包括PCR验证及WB 全膜验证结果）
• 20 μL 验证使用的WB抗体