产品简介
胶原蛋白是结缔组织和内脏器官细胞外基质的主要构造成分，但在皮肤、肌腱、骨骼中分布最为广泛。从遗传和结构上胶原蛋白分为许多类型。胶原蛋白 I（Collagen, Type I）是由 2 个 α1 链和 1 个 α2 链组成的异源多聚体，在 37℃，中性 pH 下自发形成三螺旋骨架，是一种优秀的细胞培养用基质，广泛用于肝细胞、成纤维细胞、脊神经节、肌肉细胞、施万细胞、胚肺细胞、上皮细胞和其他大量细胞系。还能用于研究细胞生长、分化、迁移以及发育过程中的组织形态发生。
EnkiLife提供的鼠尾胶原蛋白 I 是根据 Birkedal-Hansen 方法，通过醋酸抽提、氯化钠沉淀、磷酸氢二钠沉淀等步骤制备。可用于包被细胞培养器皿，培养细胞表面粘附性，特别适合那些在普通培养器皿表面不易贴壁的细胞，比如成纤维细胞、肝细胞等原代细胞。还可用于三维胶的制备，模拟真实的生长环境，使得细胞在三维环境中生长。
本品为溶于 6mM HAc 的无菌溶液，浓度 5mg/ml，每个批次产品皆通过细胞培养测试（包括三维空间培养）以保证质量的可靠性。
使用方法
1、细胞培养器皿的表面包被
组织培养器皿的表面包被推荐浓度为 1-5µg/cm2 ，起始浓度可首选 5µg/cm2 。建议根据具体细胞类型来优化。
1.1 6mM HAc 稀释液的制备
本品以溶于 6mM HAc（=0.36g/L HAc）的无菌溶液形式提供，本身不溶于中性 pH，建议用 6mM HAc 溶液做进一步稀释。
配制方法：取 34.5µl 冰醋酸（17.4 M）加入 100ml 双蒸水，充分混匀后即得到 6mM HAc 溶液，0.22µm 滤膜过滤除菌后待用。
1.2 包被步骤
a，根据自身实验体系以及优化后的包被浓度来计算所需的胶原蛋白量，并加入相应孔内，确保胶原蛋白溶液完全覆盖表面。
1）以包被浓度为 5µg/cm2 ，先用 6mM HAc 稀释液将胶原蛋白（5mg/ml）稀释到合适的中间浓度，如 50µg/ml，然后参考表 1 不同培养皿内胶原蛋白加量表 来加量到各孔内；
2）以包被浓度为 2µg/cm2 ，先用 6mM HAc 稀释液将胶原蛋白（5mg/ml）稀释到合适的中间浓度，如 12µg/ml，然后参考表 1 不同培养皿内胶原蛋白加量表来加量到各孔内；
表 1 不同培养皿内胶原蛋白加量表
培养器皿 | 每孔/皿表面积（cm2 ） | 当包被浓度：2µg/cm2 ，中间稀释浓度：12µg/ml，加入该稀释液的体积（µl） | 当包被浓度：5µg/cm2 ，中间稀释浓度：50µg/ml，加入该稀释液的体积（µl） |
96 well | 0.3 | 50 | 30 |
24 well | 1.9 | 300 | 190 |
12 well | 3.8 | 600 | 380 |
6 well | 9.5 | 1580 | 950 |
35mm | 8 | 1330 | 800 |
60mm | 21 | 3500 | 2100 |
100mm | 55 | 9170 | 5500 |
b，室温孵育 1h，小心吸掉多余液体，用无菌 PBS 清洗 3~4 次后直接使用。或者加完胶原蛋白溶液后，在超净台内开盖过夜晾干。无菌条件下，包被好的器皿在 4-25℃至少可保存 3 个月。
2. 三维胶原的制备
当鼠尾胶原蛋白 I 使用浓度>1mg/ml，pH 7.0 左右皆可形成具有一定强度的三维胶，建议成胶浓度为 1-2 mg/ml。
由于本品是以溶于 6mM HAc 的无菌溶液形式提供，在成胶过程需先加入 0.06 倍体积的 0.1M NaOH 中和。
2.1 需要溶液准备（无菌、预冷）；
10×PBS（可含酚红）或 10×细胞培养液；
0.1M NaOH ；
双蒸水 。
2.2 三维胶原制备（不含细胞）（以配制 1ml，1mg/ml 三维胶为例）：
a，取 200µl 胶原蛋白（5mg/ml）加到置于冰浴的离心管内，加入 690µl 无菌水。之后加到 12µl 0.1M NaOH【注意：该步骤不能反，如果反过来把 12µl 0.1M NaOH 加到胶原溶液中，会由于 NaOH 不能迅速混匀而产生局部的胶原凝结】，立即混匀。再加入 100µl 10×PBS 或 10×细胞培养液，混匀后立即加到培养器皿中【注意：混匀后 pH 为 7.0 左右，如果 PBS 或培养液中没有加酚红，初次使用时需要用 pH 试纸测试】。
b，将培养器皿在室温（25℃左右）放置 20min 待胶凝固后，转移到培养箱内。【注意】：如果配制中使用的是 10×PBS，需要在做细胞培养前，先加入适当体积的细胞培养液预平衡。
2.3 三维胶原制备（含细胞）（以配制 1ml，1mg/ml 三维胶为例）：
a，准备好细胞悬液，并放置于冰浴中。
b，将 200µl 胶原蛋白（5mg/ml）加到 12µl 0.1M NaOH【注意：该步骤不能反，如果反过来把 12µl 0.1M NaOH加到胶原溶液中，会由于 NaOH 不能迅速混匀而产生局部的胶原凝结】，立即混匀。再加入 23µl 10×PBS或者 10×细胞培养液，立即混匀【注意：混匀后 pH 为 7.0 左右，如果 PBS 或培养液中没有加酚红，初次使用时需要用 pH 试纸测试】。再加入 760µl 的细胞悬浮液，混匀后立即加到培养器皿中。
c，将培养器皿在室温（25℃左右）放置 20min 待胶凝固后，加入适当体积细胞培养液，转移到培养箱中培养。
注意事项
1、整个操作请于冰上进行，因室温鼠尾胶原 I 可迅速成胶，操作过程尽量保持低温；
2、整个操作请在无菌环境下无菌操作，避免污染以影响细胞生长；
3、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作；
4、本产品仅用于科研或进一步研究使用，不用于诊断和治疗。
