文献分享：多重免疫荧光解析早期三阴性乳腺癌-EnkiLife

文献分享：多重免疫荧光解析早期三阴性乳腺癌

背景

三阴性乳腺癌（TNBC）是乳腺癌中最具侵袭性的亚型，晚期患者预后极差且治疗选择有限。与其他乳腺癌亚型相比，TNBC具有较高的免疫原性，肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）富集度高， PD-L1表达水平高，因此成为免疫治疗的潜在适宜人群。已有研究证实，基质肿瘤浸润淋巴细胞（sTILs）在TNBC中具有预后预测价值，且能预测新辅助和辅助化疗的疗效，但目前TILs尚未被纳入常规临床评估体系。国际乳腺癌研究组（IBCSG）22-00试验是一项Ⅲ期随机临床试验，旨在评估早期激素受体阴性乳腺癌患者在标准辅助化疗后，接受低剂量口服环磷酰胺-甲氨蝶呤（CM）维持治疗的疗效。前期研究发现，CM维持治疗对TNBC患者复发风险的降低无显著统计学意义，但sTILs水平较高（>500）的患者接受CM维持治疗后，乳腺癌复发风险降低更为明显。基于此，Rusakiewicz S等人通过6重免疫荧光染色技术表征TNBC患者的免疫细胞浸润特征，评估特定免疫细胞亚群的预后价值和对CM维持治疗疗效的预测作用，同时分析免疫细胞的空间分布特征对治疗疗效和患者预后的影响，为TNBC患者的精准治疗策略制定提供依据。

研究方法

研究队列源自IBCSG 22-00试验的意向治疗人群，经中心病理复查确认TNBC状态，且有福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片和TILs检测结果。对 FFPE 组织切片进行 HE 染色和多重免疫荧光（mIF）染色，HE 染色切片经病理医师审核，确认组织肿瘤含量并划定感兴趣区域。mIF 染色经脱蜡、表位修复、内源性过氧化物酶封闭后，按序孵育 CD4、FOXP3、CD3、细胞角蛋白、CD8 对应的一抗、HRP 标记二抗及特异性荧光染料，最后经 Spectral DAPI 染核、封片，4℃避光保存，并于 48h 内通过 Vectra 3.0 成像系统获取多重IF图像。采集每个通道中各荧光染料及肿瘤组织自发荧光的组织特异性和通道特异性光谱库，以实现最佳的免疫荧光信号解混和多重分析。对免疫荧光染色切片进行 10 倍物镜预扫描后，利用 Phenochart™全切片观察软件标注出包含肿瘤胰岛和间质的感兴趣区域，随后以 20 倍物镜采集高分辨率多光谱图像。利用 inForm 2.3.0 软件，基于细胞角蛋白染色区分肿瘤与间质区域，利用 DAPI 染色进行细胞分割，通过主动学习表型算法量化免疫细胞亚群，最终经自研 R 脚本导出并处理细胞群体数据。同时基于CD3⁺细胞在基质和上皮内的浸润情况，将肿瘤分为炎症型（CD3⁺细胞同时浸润基质和肿瘤）、排斥型（CD3⁺细胞主要浸润基质）和冷肿瘤（CD3⁺细胞浸润极少）三类。

免疫细胞浸润与患者预后的关联

Fig. 1

对 204 例患者的肿瘤组织切片开展了多重免疫荧光检测，来观察肿瘤里免疫细胞的浸润情况。实验同时标记了 6 种关键指标：用CK定位癌细胞，用 CD3、CD4、CD8 标记不同类型的 T 细胞，用 FoxP3 标记具有免疫抑制作用的调节性 T 细胞，最后用 DAPI 标记所有细胞的细胞核。图里能清晰看到每一种指标单独的染色效果、对应的组织明场图像，以及指标组合后的染色结果。从这个病例的检测结果发现，该肿瘤样本虽存在丰富的免疫浸润，但无免疫细胞浸润至 CK 阳性的肿瘤细胞巢区域。

Fig. 2

采用主成分分析对所有免疫细胞浸润数据进行多变量分析，结果显示，第一主成分就能解释所有检测指标 73% 的差异，说明这个维度可以很好地概括肿瘤的免疫浸润特征。从整体患者数据来看，肿瘤组织中免疫细胞越多，患者远处复发的风险就越低，无远处复发生存时间也越长。尤其是在淋巴结已经出现转移的患者中，这种趋势特别明显。不过还有一个相反的发现，对于淋巴结没有转移、且肿瘤中免疫细胞很少的患者，使用CM维持治疗后，他们的预后似乎有了改善，复发风险有所降低。但这个结果还需要更多患者的数据来验证，才能确认其可靠性。

免疫细胞浸润与CM维持治疗疗效的关联

Fig. 3

为明确免疫浸润对患者无远处复发生存期（DRFI）的影响，研究针对 CD3、CD4、CD8 等各 T 细胞亚群及基质肿瘤浸润淋巴细胞、上皮内肿瘤浸润淋巴细胞的作用分别开展单因素分析。高基质肿瘤浸润淋巴细胞水平与与较好的DRFI相关，特别是LN ⁺ 患者。其中 CD3 + 基质肿瘤浸润淋巴细胞的效应在未接受CM治疗组中更突出，且该标志物二分类变量与治疗组间的统计学显著交互作用显示，CM治疗或可改善低基质肿瘤浸润淋巴细胞水平总体人群及淋巴结阴性患者的DRFI。肿瘤组织中高上皮内肿瘤浸润淋巴细胞水平对DRFI的改善作用较弱，且仅体现在淋巴结阳性肿瘤患者中，而针对淋巴结阳性且上皮内 CD8 + 肿瘤浸润淋巴细胞水平较低的患者，CM维持治疗或产生不利影响。

Fig. 4

研究进一步结合治疗方案及基质、上皮内调节性 T 细胞的浸润水平评估患者DRFI，相关结果如上图。淋巴结阳性患者中，高基质调节性 T 细胞与高上皮内调节性 T 细胞水平均与更长的DRFI相关，而基质或上皮内调节性 T 细胞水平较低的患者接受CM维持治疗或产生不利影响。

免疫细胞空间分布的影响

Fig. 5

最后，研究通过评估 204 例三阴性乳腺癌样本中免疫细胞的空间分布特征，并依据基质 CD3+ T 细胞与上皮内 CD3+ T 细胞的浸润状态对样本进行分类。首先对选定的肿瘤感兴趣区域进行可视化处理，同时在图 B 中呈现了免疫炎症型、免疫排斥型及单一免疫冷肿瘤病例的典型示例，图 C 则展示了 203 例三阴性乳腺癌样本中 CD3 排斥型与炎症型的分布情况。基于该分类开展的DRFI分析显示，CM维持治疗可能对 T 细胞排斥型的淋巴结阳性样本产生不利影响。

总结

在该关于三阴性乳腺癌的研究中，多重免疫荧光技术是解析肿瘤免疫微环境、挖掘免疫浸润与预后及治疗疗效关联的核心技术，其通过6种标志物联合染色精准识别并定量CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺ T细胞及调节性T细胞，明确这些免疫细胞在肿瘤基质与上皮内的浸润位置并区分基质/上皮内肿瘤浸润淋巴细胞，为免疫分型提供基础数据，同时借助其获得的免疫数据能够揭示高CD3⁺ T细胞及调节性T细胞浸润与DRFI的关联，明确不同免疫特征对CM治疗疗效的影响，为筛选治疗适用人群提供免疫表型依据。此外该技术还可通过多光谱成像可视化免疫细胞空间分布，成功将TNBC样本分为炎症型、排斥型及冷肿瘤，为临床分层提供技术支撑，且能协同HE染色验证组织含量，结合自动化工具实现单细胞精准量化，规避单一标志物局限，为统计分析提供高质量数据。

参考文献

Rusakiewicz S, Tyekucheva S, Tissot-Renaud S, Chaba K, Imbimbo M, Benedetti F, Kammler R, Hornfeld J, Munzone E, Gianni L, Thurlimann B, Láng I, Pruneri G, Gray KP, Regan MR, Loi S, Colleoni M, Viale G, Kandalaft L, Coukos G, Curigliano G. Multiplexed high-throughput immune cell imaging in patients with high-risk triple negative early breast cancer: Analysis from the International Breast Cancer Study Group (IBCSG) Trial 22-00. Eur J Cancer. 2024 Mar; 200:113535. doi: 10.1016/j.ejca.2024.113535. Epub 2024 Jan 24. PMID: 38309015.

Enkilife mIF 技术服务

提供有偿代检和分析服务
承接多色配套服务

分类	服务项目	备注
IHC染色	IHC单色标记
IF荧光染色	免疫荧光单标	不含一抗，含二抗(兔/小鼠/大鼠)、DAPI。四标以上染色需要提供多余白片做单标预实验。
IF荧光染色	荧光多标染色	不含一抗，含二抗(兔/小鼠/大鼠)、DAPI。四标以上染色需要提供多余白片做单标预实验。
全景扫描	免疫组化全景扫描	提供读片软件及原始相关文件，荧光扫描波长范围。
全景扫描	荧光标记全景扫描	提供读片软件及原始相关文件，荧光扫描波长范围。
数据分析	免疫组化及免疫荧光切片分析	可进行全片单阳性、多阳性细胞数及面积分析，也可定制分析特征病理区域，或进行空间分析、位置分析等。