不同类型样本裂解方案综合指南
几乎所有对蛋白质功能、表达、定位、修饰和相互作用的研究，都始于一个关键步骤：将蛋白质从其复杂的细胞或组织环境中释放出来，即细胞裂解与蛋白质提取。一个成功的裂解方案必须实现两个看似矛盾的目标：其一，要足够“暴力”，能够彻底打破细胞膜、细胞壁（对于植物和某些微生物）以及组织基质的屏障；其二，又要足够“温和”，可以最大限度地保护目标蛋白质免于降解、变性、氧化或非特异性聚集，从而保持其天然的结构和生物活性。
然而，生物样本的多样性为这一过程带来了巨大的挑战。坚韧的植物细胞壁、富含结缔组织的动物肌肉、充满高丰度干扰蛋白的血液样本，以及脆弱的培养细胞，其物理和化学性质迥异，决定了不存在一种“万能”的裂解方案。不恰当的方案可能导致蛋白质产量低下、特定类型的蛋白质（如膜蛋白、核蛋白）提取不完全、蛋白质被内源性蛋白酶降解，或产生与下游分析技术不兼容的裂解产物。
细胞裂解和蛋白质提取是研究细胞蛋白质的关键步骤，为蛋白质印迹、酶活性测定和质谱分析等众多下游应用奠定了基础。
一、通用裂解基础原则
1.全程低温：所有操作在冰上进行，裂解液预冷，防止蛋白降解。
2.抑制剂及时添加：使用前新鲜加入蛋白酶抑制剂（PMSF、蛋白酶抑制剂 cocktail），研究磷酸化蛋白需加磷酸酶抑制剂（钒酸钠、氟化钠、β- 甘油磷酸钠）。
3.机械破碎辅助：组织样本仅靠裂解液无法充分释放蛋白，需配合研磨、超声、匀浆仪等物理手段。
4.裂解时间控制：冰上裂解 30~60 min，避免过长时间导致蛋白降解。
5.离心澄清：裂解后 12000~14000 g，4℃离心 10~15 min，取上清即为总蛋白。
EnkiLife(恩玑生命)大分子蛋白专用细胞/组织裂解液（Cat#:RC0005）:
- 完整抽提大分子蛋白质。
- 保护蛋白质翻译后修饰（如磷酸化、糖基化、泛素化、甲基化和乙酰化）。
- 一步到位，无需添加酶抑制剂。
- 兼容细胞与组织样本。
验证数据: 样本兼容性实验
图A：使用RC0005裂解 HeLa 细胞和小鼠大脑组织（各2组样本），用mTOR (289 kDa)抗体对裂解物进行免疫印迹，裂解物上样量为50μg。
图B：使用RC0005裂解 HeLa 细胞和小鼠大脑组织（各2组样本），用GAPDH(37kDa)抗体对裂解物进行免疫印迹，裂解物上样量为50μg。
数据显示RC0005对细胞样本和组织样本均有优秀的裂解效果，同时兼容不同大小的蛋白样本。
二、细胞样本裂解
细胞样本结构简单，无细胞外基质阻碍，裂解难度最低，分为贴壁细胞与悬浮细胞两类。
1.贴壁细胞样本（HeLa、293T、肿瘤细胞等）
| 样本处理 | 弃培养液；PBS洗涤2-3次 |
|---|---|
| 裂解液推荐 | RIPA（强，完全裂解）或NP-40（温和，保留复合物） |
| 裂解方式 | 冰上孵育30 min |
| 离心条件 | 12,000-14,000 rpm，4°C，15 min，收集上清 |
| Tips | 可直接在培养皿中裂解（加裂解液后刮取） |
2. 悬浮细胞
| 样本处理 | 离心收集（500-1000 rpm，5 min）；PBS洗涤1-2次 |
|---|---|
| 裂解液推荐 | NP-40 或 RIPA |
| 裂解方式 | 冰上孵育30 min，期间每 10 min 用移液器反复吹打数次，确保细胞完全裂解 |
| 离心条件 | 12,000，4°C，10-15 min |
三、 动物组织裂解
动物组织因细胞外基质丰富、组织致密程度差异极大，需根据组织特性选择破碎方式与裂解液强度。核心原则：越致密、纤维越多的组织，机械破碎强度越高；酶活性越高的组织，抑制剂越要足量。
1. 脑组织
| 样本特点 | 脂质含量极高（髓鞘丰富），蛋白丰度中等，内源蛋白酶活性中等，质地偏软。 |
|---|---|
| 样本处理 | 新鲜取材后立即置于冰上；去除脑膜和血管；可分区（皮层、海马、小脑等） |
| 裂解液推荐 | 含 1% SDS 的强 RIPA 裂解液（增强膜蛋白溶解） |
| 机械破碎 | 组织匀浆器匀浆直至无明显肉眼可见固体 |
| 裂解方式 | 冰上孵育30分钟，间歇涡旋2-3 次 |
| 离心条件 | 12,000-14,000 rpm，4°C，15-20分钟，取中间澄清层（避开上层脂质层和下层沉淀） |
| Tips | 脑组织脂质多，离心后上层会有白色脂层，取样时务必避开，否则会影响后续 WB实验。 |
2. 肝脏组织
| 样本特点 | 蛋白含量极高，内源蛋白酶、磷酸酶活性极强，质地松软易破碎。 |
|---|---|
| 样本处理 | 去除胆囊和结缔组织；PBS 冲洗去除血液，滤纸吸干 |
| 裂解液推荐 | 常规 RIPA + 双倍剂量蛋白酶 / 磷酸酶抑制剂 |
| 机械破碎 | 组织匀浆器匀浆直至无明显肉眼可见固体 |
| 裂解方式 | 冰上裂解 30 min，间歇涡旋2-3 次 |
| 离心条件 | 12,000-14,000 rpm，4°C，15分钟，取上清 |
| Tips | · 肝脏蛋白酶活性极强，PMSF 需临用前添加，且浓度提高至 2 mM。 · 血液会干扰蛋白定量，务必用 PBS 充分灌流或冲洗干净。 · 肝脏蛋白浓度高，后续定量时需加大稀释倍数。 |
3. 心脏/肌肉组织
| 样本特点 | 肌纤维丰富、组织致密，机械强度高，普通匀浆难以充分破碎；线粒体蛋白丰富 |
|---|---|
| 裂解液推荐 | 强 RIPA + 超声辅助破碎 |
| 机械破碎 | 液氮研磨最佳，研磨至无颗粒感 |
| 裂解方式 | 冰上裂解 30 min，期间超声辅助破碎 |
| 离心条件 | 12,000-14,000 rpm，4°C，20分钟 |
| Tips | · 液氮研磨是肌肉组织最有效的破碎方式，研磨不充分会导致得率极低。 · 超声避免产生泡沫，防止蛋白氧化变性。 |
4. 肾脏组织
| 样本特点 | 血管网络密集，血液残留量大；皮质（肾小球、肾小管为主）与髓质蛋白表达谱差异显著；组织质地偏韧，细胞外基质含量中等；内源蛋白酶、磷酸酶活性较强，且含大量膜转运蛋白、离子通道与受体蛋白。 |
|---|---|
| 样本处理 | 去除肾包膜；可分区（皮质/髓质） |
| 裂解液推荐 | RIPA 裂解液（强）；研究膜转运蛋白可选用含 1% SDS 的增强型 RIPA |
| 机械破碎 | 组织匀浆器匀浆直至无明显肉眼可见固体；质地偏韧的样本也可先液氮研磨成细粉，再加入裂解液重悬。 |
| 裂解方式 | 冰上裂解 30 min，每 10 min 涡旋混匀一次 |
| 离心条件 | 12,000 rpm，4°C，15-20 min，吸取中间澄清上清，弃去底层细胞碎片沉淀及表层少量脂膜。 |
| Tips | · 血液残留是肾脏样本最核心的干扰因素，会导致白蛋白、血红蛋白等血液蛋白占比过高，掩盖内源组织蛋白条带，务必通过在体灌流或离体反复漂洗充分去除血液。 · 肾脏皮质与髓质功能、蛋白谱差异极大，实验设计需明确取材部位；常规总蛋白提取优先选取肾皮质，目标蛋白丰度更高、结果更稳定。 · 肾脏内源磷酸酶活性较高，研究磷酸化修饰蛋白时，需新鲜配制并加入足量磷酸酶抑制剂，全程严格低温操作，避免磷酸化信号衰减。 |
5. 脂肪组织
| 样本特点 | 脂质占比极高，蛋白含量极低，常规方法得率差 |
|---|---|
| 样本处理 | 去除血管和结缔组织；尽量去除多余脂肪；PBS 冲洗，剪碎 |
| 裂解液推荐 | 含1-2% SDS的裂解液（脂质需高浓度去污剂） |
| 机械破碎 | 组织匀浆器匀浆直至无明显肉眼可见固体 |
| 裂解方式 | 冰上裂解 30 min |
| 离心条件 | 12,000 rpm，4°C，20 min，小心吸取下层水相蛋白溶液，完全弃去上层油脂。必要时用氯仿 - 甲醇法沉淀蛋白，去除残留脂质。 |
| Tips | · 脂肪组织蛋白得率低，需加大初始样本量。 · 离心后脂层与水相分界明显，取样时枪头穿过脂层时避免带入油脂。 · 油脂残留会导致 SDS-PAGE 电泳条带弥散、泳道拖尾。 |
6. 脾脏
| 样本特点 | 血窦系统高度发达，血液残留量极大，红细胞占比高；组织质地松软，内源蛋白酶与核酸酶活性较强，易出现蛋白降解，血液蛋白易掩盖内源组织蛋白信号。 |
|---|---|
| 样本处理 | 脾脏用预冷 PBS 反复冲洗表面，轻柔挤压排出血窦内残血，有条件优先采用心脏灌注取材以彻底去除血液 |
| 裂解液推荐 | RIPA 裂解液（强） |
| 机械破碎 | 组织匀浆器匀浆直至无明显肉眼可见固体 |
| 裂解方式 | 冰上静置裂解 30 min |
| 离心条件 | 12,000 rpm，4°C，15-20 min，吸取中间澄清蛋白上清，避开底层细胞碎片与红细胞沉淀 |
| Tips | · 严控血液污染：灌注取材是最优解决方案；若离心后上清仍偏红，可再次低速离心去除残留红细胞。 · 防范蛋白降解：免疫细胞内源蛋白酶活性高，取材后禁止室温放置，需立即液氮速冻或全程冰上操作。 |
7. 肠道组织
| 样本特点 | （1） 结构分层明显，蛋白谱差异大； （2） 腔内杂质多，污染风险高； （3） 蛋白降解风险极高 |
|---|---|
| 样本处理 | 按实验需求截取对应肠段（十二指肠 / 空肠 / 回肠 / 结肠），纵向剪开，去除内容物；PBS轻柔冲洗；可分离黏膜/肌层 |
| 裂解液推荐 | RIPA裂解液 |
| 机械破碎 | （1） 黏膜层样本：组织匀浆器匀浆直至无明显肉眼可见固体。 （2） 全层 / 肌层样本：液氮中研磨成均匀细粉，再加入裂解液重悬。 |
| 裂解条件 | 冰上静置裂解 30 min，每 10 min 轻涡旋混匀一次 |
| 离心条件 | 12,000 rpm，4°C，15分钟，若上清仍浑浊黏稠，可重复离心一次，或经短暂超声后再次离心。 |
| Tips | · 黏液干扰，需充分冲洗。 · 蛋白酶活性高，肠道蛋白酶种类多、活性强，必须搭配广谱蛋白酶抑制剂 cocktail，PMSF 终浓度可提高至 2 mM。 |
8. 血液
| 样本类型 | 特点 | 处理方式 |
|---|---|---|
| 全血 | 含红细胞、白细胞、血小板及血浆蛋白 |
|
| 血清 | 去除血细胞和纤维蛋白原后的上清 | 新鲜全血室温静置 30~60 min 待充分凝血，3000 g、4℃离心 15 min，小心吸取上层淡黄色澄清血清，避免触碰中间白细胞层与底层红细胞。（直接稀释使用，无需裂解） |
| 血浆 | 含抗凝剂，保留纤维蛋白原 | EDTA 抗凝全血颠倒混匀后，3000 g、4℃离心 15 min，取上层血浆。（直接稀释使用，无需裂解） |
| 血细胞（PBMC/白细胞） | 需裂解红细胞后分离 | 1. PBMC 分离（密度梯度离心法） （1）新鲜 EDTA 抗凝血与等体积 PBS 稀释混匀，沿管壁缓慢叠加到 Ficoll-Paque 分离液液面上方，保持界面清晰。 （2）2000 g、室温离心 20 min（升降速调至最低，避免打破界面）。 （3）小心吸取中间乳白色的 PBMC 白膜层，转移至新离心管，加入 5~10 倍体积预冷 PBS 重悬洗涤。 （4）1500 g、4℃离心 10 min，弃上清；重复洗涤 1~2 次，彻底去除残留血小板与分离液。 2. 细胞裂解： 按每 1×10⁷细胞加入 100~200 μL 预冷裂解液，吹打重悬均匀，冰上裂解 30 min，每 10 min 轻涡旋一次。 3. 离心取上清： 14000 g、4℃离心 15 min，吸取中间澄清蛋白上清，弃底层细胞碎片沉淀。 |
四、 植物组织裂解
植物样本有坚韧的细胞壁，且富含多酚、多糖、次生代谢物，易导致蛋白氧化褐变、沉淀，是裂解难度最高的样本类型。核心策略：液氮研磨破壁 + 多酚 / 多糖去除手段。且植物样本极易氧化，建议裂解后1个月内使用完，未裂解的样本，有条件的液氮保存，没条件的-80℃保存，再没条件的，-20℃保存不要超过1个月。
液氮研磨标准流程
| 步骤 | 操作 | 关键要点 |
|---|---|---|
| 研钵预冷 | 液氮预冷研钵 | 严禁干磨，液氮不足及时补充 |
| 取样 | -80℃或液氮保存组织 | 立即用液氮冷冻 |
| 研磨 | 液氮研磨成细粉 | 保持低温，防止组织复冻 |
| 收集 | 液氮蒸发后用预冷药匙转移粉末 | 粉末装入含β-巯基乙醇的离心管 |
| 裂解 | 加入99:1裂解液 + 超声破碎 | 无需额外匀浆步骤 |
| 静置 | 4℃静置20-30分钟 | 使蛋白充分释放 |
| 离心 | 12,000-14,000 rpm离心15-20分钟取上清 | 底部白色沉淀可冷冻保存备用 |
1. 叶片组织
| 样本特点 | 细胞壁较薄，易研磨；叶绿体丰富，Rubisco（核酮糖二磷酸羧化酶）占比极高，易掩盖低丰度蛋白；多酚含量中等。 |
|---|---|
| 样本处理 | 液氮速冻；研磨成细粉 |
| 裂解液推荐 | 植物 RIPA + 1% PVP + 10 mM β- 巯基乙醇 |
| 机械破碎 | 液氮研磨首选 |
| 离心条件 | 12,000-14,000 rpm，4°C，15-20分钟,取上清；若上清仍有色素，可重复离心一次 |
| Tips | · 去除高丰度 Rubisco 可使用专门的植物蛋白富集试剂盒，提升低丰度蛋白检测灵敏度。 · 幼嫩叶片比老叶更容易提取，蛋白完整性更好。 · 叶绿素等色素会干扰 BCA 定量，建议用 Bradford 法或 2-D 定量试剂盒。 |
2.根组织
| 样本特点 | 纤维丰富，杂质多，多糖和次生代谢物含量高，易褐变；根表土壤易污染样本。 |
|---|---|
| 样本处理 | 清洗去除土壤；液氮速冻；研磨成细粉 |
| 裂解液推荐 | 含 2% PVP、5% 甘油的裂解液，配合 TCA - 丙酮沉淀纯化 |
| 机械破碎 | 液氮研磨 |
| 离心条件 | 12,000 rpm，4°C，15分钟 |
| Tips | · 根系样本杂质多，直接裂解的样品杂质含量高，严重影响电泳质量，建议 TCA - 丙酮沉淀纯化。 · 幼根比老根蛋白含量高、木质化程度低，优先选取根尖部位。 |
3.茎/枝干组织
| 样本特点 | 木质化程度高，纤维多，细胞壁厚且坚硬，研磨难度大；蛋白含量低于叶片 |
|---|---|
| 样本处理 | 去除表皮；剪取幼嫩部分剪成小块；液氮速冻 |
| 裂解液推荐 | 强裂解配方（含 2% SDS） |
| 机械破碎 | 液氮研磨（木质化组织必需） |
| 离心条件 | 14,000 rpm，4°C，20分钟 |
| Tips | · 木质化茎秆务必充分研磨，肉眼看不到纤维颗粒才算合格。 · 加热辅助裂解可显著提高蛋白得率，但不适用于需要保持蛋白天然活性的实验。 |
4. 花
| 样本特点 | 花是植物繁殖器官中结构异质性最强、次生代谢物干扰最严重的类型之一，核心裂解难点集中在褐变控制与低丰度蛋白富集 |
|---|---|
| 样本处理 | 新鲜取材后立即置于冰上，根据实验需求分离目标部位（如仅取花瓣、雄蕊或雌蕊），去除枯萎组织与表面杂质。用预冷蒸馏水快速冲洗 1 次，滤纸吸干表面水分，全程减少室温暴露。 |
| 机械破碎 | 液氮研磨 |
| 蛋白裂解方法一 | 直接裂解法（适用于花蕊、花柄等褐变较轻的部位）： · 按 1:5~1:8（质量：体积）加入预冷裂解液，快速涡旋混匀后立即置于冰上。 · 冰上裂解 30 min，每 10 min 轻涡旋混匀一次。 · 14000 g、4℃离心 20 min，吸取中间澄清蛋白上清，弃去底部细胞碎片与表层色素漂浮层。 · 若上清仍有明显颜色，可加入少量 PVPP 吸附多酚，再次离心澄清。 |
| 蛋白裂解方法二 | TCA - 丙酮沉淀法（花瓣等高色素样本首选）： · 研磨粉末转移至预冷 EP 管，加入 3 倍体积的预冷 10% TCA - 丙酮溶液（含 0.07% β- 巯基乙醇），充分混匀。 · -20℃沉淀 2 h 以上（或过夜），期间颠倒混匀 1~2 次。 · 12000 g、4℃离心 15 min，弃上清。 · 用 80% 预冷丙酮洗涤沉淀 3 次，每次离心后彻底弃上清，去除残留 TCA。 · 室温通风处风干 5~10 min 至无丙酮气味（不可过度干燥，否则蛋白难以复溶）。 · 加入适量裂解液涡旋重悬，冰上孵育 30 min 助溶。 · 14000 g 离心 15 min，取上清即为纯化后的蛋白样品。 |
5. 种子
| 样本特点 | 坚硬种皮破壁、高含量储存杂质去除，以及内源酶活化导致的蛋白降解 |
|---|---|
| 样本处理 | 根据实验需求去除种皮，分离胚、胚乳等目标部位；蒸馏水快速冲洗表面灰尘，滤纸吸干水分。干燥种子直接液氮研磨，严禁浸泡水化，防止内源酶活化降解蛋白。 |
| 裂解液推荐 | 1. 淀粉 / 蛋白类种子：含 2% SDS 的强裂解液或植物强 RIPA 裂解液；高纯度需求搭配 TCA - 丙酮沉淀纯化。 2. 油料种子：强 RIPA 裂解液，必须搭配正己烷 / 石油醚脱脂预处理 |
| 机械破碎 | 液氮研磨 |
| 蛋白裂解方法一 | 淀粉 / 蛋白类种子（水稻、小麦、豆类等）： · 按 1:10（质量：体积）加入预冷裂解液，快速涡旋混匀，冰上裂解 30 min，每 10 min 涡旋一次。 · 14000 g、4℃离心 20 min，吸取中间澄清上清；若下层淀粉沉淀厚重，可重复离心一次去除残留淀粉颗粒。 · 高纯度实验需求：研磨后直接用 10% TCA - 丙酮溶液沉淀蛋白，步骤同花组织沉淀法，可彻底去除淀粉、多糖与多酚杂质。 |
| 蛋白裂解方法二 | 油料种子（花生、油菜籽、芝麻等）： · 研磨粉末加入预冷正己烷（或石油醚），涡旋混匀后静置 10 min，12000 g 离心 5 min 弃上清；重复脱脂 2~3 次。 · 通风处风干至无有机溶剂残留（约 5 min），避免有机溶剂导致蛋白变性。 · 加入预冷强 RIPA 裂解液，涡旋混匀，冰上裂解 30 min。 · 14000 g、4℃离心 20 min，小心吸取下层水相蛋白溶液，彻底避开表层残留油脂。 |
五、RIPA裂解专属关键注意事项（避坑重点）
1. 抑制剂必须现加：PMSF在水溶液中极易降解，必须临用前加入RIPA，不可提前配制储存。
3. 低温操作：全程冰上/4℃操作，RIPA裂解过程产热会导致蛋白降解、磷酸化位点丢失。
4. 样本比例勿过量：组织/细胞过多、裂解液不足，会导致裂解不完全、蛋白浓度偏低、杂质过多。
5. 上清取用规范：离心后仅取清亮上清，坚决避免吸取油脂、沉淀，防止后续WB条带杂带、背景脏。
| EnkiLife（恩玑生命）产品货号 | EnkiLife（恩玑生命）产品名称 |
|---|---|
| RA10020 | 2h极速WB即用型全流程试剂盒 |
| RA10042 | 畅享版WB全流程试剂盒 |
| G0142012 | Bis-Tris, 4-20%, 12wells |
| G0142015 | Bis-Tris, 4-20%, 15wells |
| RA10043 | 即凝广谱梯度制胶试剂盒 |
| RC0005 | 大分子蛋白专用细胞/组织裂解液 |
| RC0160 | RIPA裂解液（强） |
| RC0161 | RIPA裂解液（中） |
| RC0162 | RIPA裂解液（弱） |
| RA10063 | 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液(100×，不含EDTA） |
| RA10066 | 蛋白酶抑制剂混合物(100x，不含EDTA) |
| RA10067 | 磷酸酶抑制剂 II cocktail（50x） |
| BC00006 | 蛋白浓度测定试剂盒(BCA法) |
| RA10055 | 5×上样缓冲液 |
| RA10037 | 校准级彩色预染蛋白Marker（8-180kDa） |
| RA10038 | 校准级彩色预染蛋白Marker（10-250kDa） |
| RA10039 | 校准级高分子彩色预染蛋白Marker（25-400kDa） |
| RA10044 | 20×通用型快速电泳液 |
| RA10051 | 20×免冰浴快速转膜液 |
| RA022 | PVDF膜（0.22μm） |
| RA045 | PVDF膜（0.45μm） |
| RA10052 | 5×无蛋白快速封闭稀释液 |
| RA10058 | 5min无蛋白快速封闭液 |
| RA10059 | 1min无蛋白快速封闭液 |
| RA10056 | 免封闭快速抗体稀释液 |
| RA10001 | 超敏ECL化学发光液 |
| RA10041 | 抗体剥离液 |
| RA10057 | 考马斯亮蓝快速染色液(免脱色) |
| RA10061 | 10×TBST |