Q1:原代细胞与细胞系有什么区别?
A1:根据传统定义，自组织第一次收获和接种的细胞被称为原代细胞 [Freshney, R.I. (1987). Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Technique. (New York, Alan R. Liss, Inc.)]. 这类细胞直接从组织分离，生命周期有限，经数次传代后会逐渐停止生长。原代细胞在有限的生命周期内需掌握好细胞的最大生长空间，以保持细胞群中基因型和表型的一致性。细胞系是不断生长、分化的细胞群，因其经过遗传改造，致使其具有无限增长的潜能。体外生长的细胞系用于医疗或科研。
Q2:倍增和代数有什么区别?
A2:倍增是培养物中细胞总数的翻倍，通常是指细胞指数或对数生长期。代数是指细胞群从培养瓶中移出，传代培养过程的次数；传代培养的目的，是使细胞处于低密度以刺激其进一步生长。
Q3:细胞培养过程中，多久更换一次培养基?
A3:这取决于细胞生长的速度。一般而言2-3天更换一次培养基，许多细胞培养实验室通常在周一，周三，周五更换培养基。注意：冻存细胞复苏后，在6-16小时内更换培养基，以去除残留的二甲基亚枫和死亡的细胞。
Q4:可以扩增培养和再次冻存原代正常人类细胞吗?
A4:这取决于细胞的类型。一些细胞类型像神经细胞，神经胶质细胞和一些生长缓慢的上皮细胞，不推荐扩增培养和再次冻存。其它的细胞类型像成纤维细胞、星形细胞、肾系膜细胞、星形胶质细胞等等，可以扩增培养和再次冻存。然而，需要注意的是再次冻存的过程可能导致细胞生长性能的改变。
Q5:培养瓶中应该加入多少体积的培养基?
A5:我们推荐的用量为：T-25培养瓶5ml，T-75培养瓶15ml，T-150培养瓶30ml。
Q6:原代细胞培养，细胞贴壁不好怎么办？
A6:许多原代细胞必须添加促贴壁物质才能贴壁生长，我们可以提前包被细胞培养瓶，常用的包被液有多聚赖氨酸和纤粘连蛋白、层粘连蛋白、玻璃粘连蛋白、明胶、胶原蛋白、MSC 促贴壁试剂、刀豆蛋白A等。或者可以直接购买细胞瓶表面已经处理的耗材。如：TC细胞培养表面；Nunclon Delta 细胞培养表面；用于球体培养、组织化培养和3D培养的培养瓶；包被多聚-D-赖氨酸或 I 型胶原的T25培养瓶等。
Q7:培养的细胞不贴壁怎么办？
A7:可能的原因：
(1) 胰蛋白酶消化过度。
(2) 支原体污染。
(3) 部分细胞需要额外添加贴壁因子
(4) 培养器皿使用不当，如使用了非TC处理的培养瓶。
解决方法：
(1) 缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度。
(2) 分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱，如发现支原体污染，丢弃培养物。
(3) 改变培养液成分。
(4) 使用合适的培养器皿。
Q8:细胞复苏、冻存注意事项有哪些？
A8:注意事项
(1) 细胞冻存时，一定要确保细胞状态良好：处于生长对数期，密度适中（一般70%-80%），且没有污染；
(2) 冻存过程中处理细胞要轻柔，消化时间不宜过长，避免反复吹打细胞；
(3) 冻存细胞数量需合适：冻存液一般为1ml每管，细胞量在2*106左右，对于易死的细胞或有密度依赖性的细胞，细胞数量可在5*106左右；
(4) 细胞冻存时，确保盖子拧紧，并选择配套的管子和盖子；
(5) 冻存细胞时，不可直接将细胞放入-80℃，需严格进行梯度降温，且-80℃的细胞过夜冻存后尽快转移至液氮罐中长期保存；
(6) 细胞复苏时，水浴时间不宜过长，若室温较低可适当的提高水浴温度至38℃；
(7) 复苏时从液氮罐拿出之后，马上放到水浴锅中进行融解，期间可以晃动冻存管有助于快速融化，并且尽快离心去除冻存液，减少冻存液对细胞的伤害；
(8) 吹打细胞时要轻柔，同时使用预热的完全培养基培养细胞。
Q9:细胞周围和细胞上有很多小黑点应该怎么办？
A9:细胞出现黑点一般判定为细胞碎片或血清沉淀杂质。如果是悬浮细胞：低速离心（500-600 rpm，5-6 min）收集细胞上清，并更换培养皿；如果是贴壁细胞：将细胞用PBS洗2-3遍，洗的时候轻轻拍打培养皿，让贴壁不牢的碎片和颗粒脱落，再弃去PBS，消化时先加低浓度的胰酶，如0.05%胰酶消化1 min左右，让细胞间隙中的碎片脱落下来，去掉低浓度胰酶，然后正常消化细胞，将收集的细胞悬液低速离心（500-600 rpm，5-6 min），并更换新的细胞培养皿，并可尝试适当增加血清浓度进行培养；如果怀疑黑点是支原体污染，可进行支原体检测。
Q10:细胞背景较脏？
A10:可能原因：
(1) 细胞刚复苏，有较多死细胞；
(2) 细胞状态差，分泌物增多；
(3) 细胞污染。
解决办法：
(1) 将旧培养基全部去除，用PBS润洗两遍，加入新鲜培养基；
(2) 更换新鲜培养基，增加血清含量；
(3) 建议直接将细胞丢弃重新复苏细胞。
Q11:细胞分化严重？
A11:可能原因：
(1) 传代次数过多；
(2) 传代时吹打过于剧烈；
(3) 细胞本身较敏感。
解决办法：
(1) 降低传代次数，并在传代次数较少时冻存保种；
(2) 传代吹打细胞时动作轻柔；
(3) 对于敏感细胞，试剂和操作需温和，例如，提前预热试剂；用不含EDTA的胰酶消化；改用细胞刮处理细胞。
Q12:细胞生长缓慢？
A12：可能原因
(1) 是否更换了新的血清或培养基批次，细胞需要一段时间适应；
(2) 培养基中缺少某些生长因子，如果实验室没有最适宜的培养基，可以先用原培养条件冻存一些，然后逐渐增加新的培养基比例，25%、50%、75%到100%，传代3-5次后，让细胞慢慢适应；
(3) 判断是不是培养基发生污染，可以先不加抗生素，观察细胞状态；
(4) 当传代接种量过少时，细胞增长变慢，影响细胞状态，建议增加细胞的接种密度；
(5) 发现细胞老化的时候，及时更换新的细胞；
(6) 如果怀疑是支原体污染，一定要隔离疑似污染的培养皿，及时清洁消毒培养箱；并加支原体清除试剂进行清除或直接丢弃细胞。
Q13：细胞内出现空泡，是否是正常现象？
A13：部分细胞本身存在一定的空泡（如HpeG2、Huh-7及一些耐药株等），这个是正常现象。如果只有少数细胞内出现极少空泡，则可能是细胞状态不佳。
Q14:细胞培养中遇到细胞空泡化怎么办？
A14:可能的原因：
(1) 细胞老化：细胞处于终末分化状态，或细胞传代次数过多，老化严重。
(2) pH值：培养液的pH值与细胞正常所需pH值差别太大。
(3) 胰酶消化：胰酶消化时间过长或消化细胞吹打时力度过大。
(4) 自噬：细胞缺乏营养导致饥饿，诱导形成自噬。
(5) 细胞代谢：血清浓度不够，药物作用、外界刺激等导致细胞代谢出现问题。
(6) 污染：衣原体感染、支原体污染、病毒污染。
解决方法：
(1) 若是因为细胞老化，可复苏代数靠前的细胞进行培养。
(2) 若是pH更换，培养液调整到合适的pH值。
(3) 传代时，胰酶的浓度合适，选取适当的消化时间进行消化，避免吹打太过用力。
(4) 保证细胞培养的营养充足，可通过增加血清浓度和在培养基中加入谷氨酰胺。
(5) 严格进行无菌操作，尽量使用质量好和渠道正规的胎牛血清。
Q15：在培养悬浮细胞时，细胞碎片和死细胞比较多怎么办？
A15：可以通过不同转速分步离心分离，先用200-300rpm离心3min，去除死细胞团和较大碎片，收集细胞上清；细胞上清600-800rpm再次离心3min，去除较小的细胞碎片，收集细胞沉淀；若细胞悬液中仍然有较多碎片，可以重复上述操作多次离心。
Q16:悬浮细胞培养时会有黑色颗粒物产生
A16:可能的原因：
(1) 细胞状态不好产生大量碎片聚集在一起；
(2) 细胞大量聚团生长，内部细胞缺氧已死亡；
(3) 细胞有污染。
解决方法：
(1) 低速离心，去除碎片，提高血清浓度调整细胞状态；
(2) 用无钙镁平衡盐溶液洗涤细胞，轻柔吹打细胞获得单细胞悬液，低密度接种于孔板培养，慢慢清除碎片；
(3) 判断是哪种细胞污染，加入对应的抗生素或支原体清除试剂；
Q17：半悬半贴细胞，贴壁不牢，容易脱落怎么办？
A17：在处理细胞时，小心操作，不要剧烈晃动培养板，需要换液时先将培养基37℃预热，枪头对着板壁缓慢打出培养基，尽量减少对细胞的刺激；有少数细胞培养甚至需要包被才能贴壁，常用的包被液有：胶原蛋白、多聚赖氨酸、纤粘连蛋白、明胶等。
Q18：细胞处理时遭遇细胞卷边漂浮的解决办法
A18：贴壁性不好的细胞，在高密度时遭遇外部刺激容易卷边漂浮，处理此类细胞时，应提前回温处理细胞所需的培养液或试剂，避免细胞突然遇冷；应使用移液枪以较轻力道将试剂打向容器内壁，避免细胞直接受到较大的外力冲击；当遭遇细胞卷边漂浮时，可将细胞消化重悬，并重新接种于容器中。
Q19:细胞培养中出现脱落原因有哪些？
A19：细胞培养中出现脱落原因有
(1) 培养基的PH值是不是合适(通常在pH7.3-7.4为合适)，细胞在培养过程中，有旺盛的代谢活动，代谢产物往往会使培养基的ph值降低，培养基颜色(有酚红指示剂的)变黄，及时换液。
(2) 细胞的培养密度，有的细胞不能长得太密，要即时传代。
(3) 若刚开始出现细胞脱落，尽快换液，洗掉死细胞，某些死细胞的物质进入培养基后，能引起细胞的大量凋亡。
Q20：用胰蛋白酶消化贴壁细胞时为什么细胞会变圆？
A20：胰蛋白酶消化贴壁细胞，使细胞会变圆，是由于贴壁细胞在经过胰蛋白酶浸泡之后，细胞会失去保护层，细胞的生长能力减弱，在这时，在细胞内部骨架的张力作用下，细胞会变成球形，而且用胰蛋白酶消化贴壁细胞时，不仅可以消化壁之间的蛋白质，长时间以往也会消化细胞中所含有的膜蛋白，从而对细胞具有一定的损伤作用，不要轻易使用。
Q21：怎么解决实验中有遇到细胞凝集的情况？
A21：培养悬浮细胞时，细胞可能由于多种多样的原因贴附形成细胞团。
引起细胞聚团的最常见原因是细胞培养基中存在游离DNA和细胞碎片，通常发生于细胞裂解后，DNA的粘性性质导致细胞和其他碎片聚合形成大的团块。
以下列举了引起细胞裂解和DNA释放到培养基中的部分原因:
(1) 过度消化，使用蛋白水解酶过度处理,如常用于细胞解离的胰蛋白酶，会造成细胞结块。
(2) 环境胁迫，机械力、重复冻融和其他环境压力可以加速细胞死亡，其早期症状可能就是细胞间粘附。
(3) 组织解离，通过化学、机械或酶学方法从原代组织制备单个细胞悬液，可能导致一些细胞破裂。从组织制备单个细胞悬液时通常需要使用胶原酶消化胞外基质。
(4) 过度生长，当细胞达到融汇时，细胞裂解产生的细胞碎片和游离DNA过度积聚。
Q22:如何判断你的细胞已经消化好了？
A22:首先需明确：细胞消化到位的标准并非是完全间隔分布、呈高度离散的单个圆形状态。通常，肉眼观察贴壁细胞层时，若细胞层开始移动并呈现沙粒状流动，即说明细胞已脱离培养基质的附着，细胞间连接也已断裂；此时细胞虽未完全离散，但已呈独立分布状态，需立即停止消化。
其次需注意：切勿等到显微镜下所有细胞完全分离、间隙显著增大时才停止消化。即便消化成完全的单细胞悬液，后续贴壁过程中细胞仍会聚集，这是贴壁培养细胞（尤其是肿瘤细胞）的固有特性。
最后需关注：若细胞形态偏离标准，可能由消化不当导致；但若消化方法正确，细胞仍成片分布（甚至经充分吹打为单细胞悬液后，贴壁时依旧成片），则属于细胞自身特性——因其在贴壁过程中会重新聚集。此时若强行追求细胞均匀分布，反而会损害细胞状态。
Q23：细胞全换液，应该怎么处理？
A23：如果是贴壁细胞，可以用全量换液法，直接吸去全部旧培养基，补充足量新鲜完全培养基。
细胞全换液具体步骤
(1) 将器材放入超净台，打开紫外照射灭菌，若是培养的细胞对温度比较敏感，可以将含血清的培养基瓶放入37℃的水浴箱使得培养基温度在37℃，再转移到超净台紫外灭菌。另外，细胞培养间也需要紫外照射半小时左右。
(2) 从培养箱取出细胞培养瓶，用酒精喷壶在瓶子表面喷洒75%酒精消毒，转移到超净台，打开盖子，轻轻吸出旧的培养液，可用移液器加入新鲜含血清培养基，注意一定不要从细胞贴壁面加入培养基，应从侧壁加，动作轻柔，以免冲落细胞。
(3) 加好培养基后，盖上盖子，在瓶子上做标记，注明换液时间，细胞种类，操作人员等信息。
(4) 放入培养箱之前应再次用酒精喷一喷瓶子表面，然后应记得整理操作台，用酒精擦拭超净台台面，清理废液和垃圾。
Q24：细胞半换液，应该怎么处理？
A24：“细胞半换液”又称“细胞半量换液”，即弃掉一半旧的培养基，再加一半新的进去。半换液原因
(1) 给细胞提供适应的缓冲环境；
(2) 细胞生长过程中可能会分泌某些生长因子，促进生长；
(3) 节省材料；
(4) 方便操作：比如96孔板，换液很麻烦。所以常采用排枪进行半换液；
(5) 对于悬浮细胞的培养，有时也会选用半换液减低细胞密度；
Q25：悬浮细胞，应该怎么换液？
A25：操作步骤
(1) 即吸去一半旧培养基；
(2) 补充新鲜完全培养基(会损失一半细胞)。
悬浮细胞如果不想损失细胞，那就需要将培养物转移到离心管中，离心去除旧培养基，再用新培养基重悬细胞沉淀。
Q26：细胞换液是否需要用PBS清洗？
A26：我们知道，在“贴壁细胞传代”中，培养基中的血清会抑制胰酶的活性，影响消化的效果，所以必须要PBS 的清洗。
但对于细胞换液，尚未查到有资料明确说明是否需要PBS清洗。
这里应该根据细胞的具体情况考虑
a.若细胞比较“娇气”或生长状态不是特别好时，建议还是不要用PBS清洗。一方面，细胞贴壁的状态可能不是很牢固，PBS的冲洗会破坏细胞的贴壁状态；另一方面，PBS可能会洗掉细胞分泌的一些生长因子，这同样不利于细胞状态的调整。如果一定要洗，可以缓慢清洗，减少对细胞的伤害；
b.当细胞生长状态不错，或者显微镜下观察细胞液中不是很干净时，可以选择用PBS清洗。一方面可以去除积累的代谢物；另一方面，也可将一些生长状态不好或衰老的细胞洗脱下来，保持细胞活力。
Q27：细胞换液应该注意哪些问题？
A27：注意事项
(1) 在进行换液操作时，全程注意无菌，操作人员要穿好灭菌服，戴好灭菌手套和口罩，手接触到细胞培养瓶瓶口时一定要小心，避免造成污染。
(2) 加培养液时，不可直接加到细胞贴壁的面上。
(3) 换液前记得观察细胞的状态及拍照记录。
Q28：在显微镜下观察到小黑点，背景比较脏，，是细胞碎片还是污染？
A28：细胞小黑点如的判断方法
(1) 运动性：很多会动的小黑点，只是发生布朗运动的细胞碎片。从运动性上比较，浮躁的细菌活跃的多。
(2) 培养基的浑浊度：如果在显微镜下无法辨认，那就交给时间吧。细胞培养基对于细菌来说是非常营养的大餐。一旦发生污染，细菌就会大量繁殖。培养基PH值迅速下降，培养基变黄且会变浑浊。通常在12小时内就可以发现，而在48小时内就非常明显。被污染的细胞培养基变黄且浑浊、未被污染的细胞培养基偏红且澄清。
(3) 接种平板：将怀疑污染物接种在微生物培养平板中，观察菌落形成情况。碎片?细菌?一目了然。
Q29：细胞碎片如何预防？
A29：状态不好的细胞往往贴壁能力较强，因此切勿用移液器进行强力的吹打，从而损害了健康的细胞；另外，控制好胰酶消化的时间，只需保证大部分正常的细胞被消化下来就可以了，然后更换新的细胞培养皿。
Q30：细胞碎片如何处理？
A30：化学或者物理的强烈刺激(例如胰酶消化时间过长，吹打细胞太过用力等)往往会导致细胞死亡，产生很多的细胞碎片。在显微镜下进行观察时，可以看到很多呈不规则形态、没有光泽的颗粒粘附在细胞培养皿的底部。
处理方法
(1) 细胞内的黑色颗粒是细胞外分泌泡及细胞器折光，折光属于细胞自身特性，无法清除也无法改变。
(2) 细胞外的黑色颗粒大部分是细胞碎片和细胞已经分泌的分泌泡，可以先换液后用PBS润洗清除，润洗不能清除的可以消化完成后加完全培养基终止消化，混匀细胞，收集细胞悬液750rpm 离心4min，弃上清。再加5ml PBS重悬细胞，再离心后，用完全培养基重悬接种到新的培养皿。第二次PBS重悬是为了去除碎片，如果平时碎片比较少，传代时可以省略PBS重悬的步骤;如果碎片很多，建议PBS多洗几次。
Q31：凋亡小体如何处理？
A31：体外培养的动物细胞很容易受到培养环境因素的影响，例如营养成分的改变、氧的供给、毒素、细胞代谢产物的积累、pH、剪切力、细胞密度及微生物污染等。这些环境的改变都有可能诱发细胞的凋亡，从而产生很多分泌的凋亡小体。凋亡小体大多游离在培养基中，但也有一些会通过暴露的核酸彼此之间相互黏连，从而形成一个棕色的凋亡小体团块，没有细胞光泽。
处理建议
细胞培养的过程中一定要控制细胞传代的时间，不能让细胞"长过";不要使用过酸或者过碱的培养基进行细胞培养;选用内毒素含量较低的血清。