mIHC-TSA 实验：关键技术要点与典型问题解答

mIHC-TSA 实验：关键技术要点与典型问题解答

一、 关键技术要点

1. 抗原修复：抗原修复通常使用1×柠檬酸（PH6.0）作为修复液，高温高压修复，将切片至于高压锅中，加入适量的修复液，关上高压锅，待上汽后计时 2min，冷却至室温，修复完毕。【如遇表达较弱的指标，则可用EDTA（PH9.0）作为修复液进行抗原修复。如遇骨组织、脑组织等易掉片组织，则采用微波修复，修复温度控制在 80℃左右，修复液可用2×柠檬酸（PH6.0）。】

2. 内源性酶阻断：用纯水配制3%H₂O₂溶液，将切片放于溶液中，室温孵育20min。如遇易掉片组织，可适当降低H₂O₂浓度和孵育时间。若样本含血红蛋白（如肝脏、脾脏），可根据实际情况延长孵育时间，避免血红蛋白导致的自发荧光。

3. 抗体选择与稀释：优先使用单克隆抗体，避免使用多克隆抗体。如果是小鼠样本，尽量避开选择小鼠来源一抗，若选择小鼠一抗，二抗除了与一抗结合，还会结合组织内源性的IgG，产生非特异性着色。一抗稀释比例需通过预实验确定，浓度过高易导致非特异性结合，过低则信号微弱。建议设置浓度梯度筛选最佳条件。

4. TSA 染料使用规范：TSA 染料为光敏性物质，工作液需现配现用。低表达靶标选择荧光强度高、抗淬灭性强的染料（如 Cy5、AF594），利用 TSA 信号放大效应增强检出率。高表达靶标选择荧光强度适中的染料（如 FITC、Cy3），避免信号饱和掩盖细节。

5. 避免光谱重叠：选择发射波长间隔≥50nm 的染料组合，例如：DAPI（461nm）+ AF488（519nm）+ Cy3（570nm）+ Cy5（670nm），可有效减少串色。避免同时使用 FITC（520nm）和 AF488（519nm）、Cy3（570nm）和 AF594（617nm）。

6. 结合成像设备：荧光型 TSA 需确认荧光通道是否与实验室显微镜波长兼容。使用普通荧光显微镜时，优先选择可见光区染料（FITC、Cy3、DAPI），避免远红外染料（Cy5）。使用共聚焦或多光谱显微镜时，可使用远红外染料（Cy5、AF647），利用多光谱分离技术进一步降低串色。

7. 抗体洗脱效率：如果有些抗体效价高，亲和力较强，不易洗脱彻底，可增加洗脱次数。抗体洗脱液流动性强，片子未水平放置时，试剂易流出圈外，影响洗脱效果，需在操作过程注意切片平放。易脱片样本可降低洗脱液温度或缩短孵育时间。

                                                                                       20×大鼠肾6标7色结果图

二、常见FAQ

1. 能否使用冰冻漂片进行TSA实验？

答：TSA试剂盒不适用于漂片。因为漂片厚度太厚，不利于试剂的渗透。漂片在染色过程中形态会发生改变，如卷曲，褶皱等。

2. 做石蜡切片 mIHC,抗体应该怎样选择？

答：尽量选用单克隆抗体，抗体应用选用 IHC /mIHC/ IHC-P，优先选用经过敲除验证的抗体。

3. 为什么会产生非特异性结合？

答：①若使用多克隆抗体，容易产生非特异性结合，可以换用单克隆抗体或者降低浓度以及修复强度来改善。②信号放大过强，可以降低染液反应时间或者浓度。③一抗浓度过高或者抗原修复过度，采用比较低的稀释抗体比例，或降低抗原修复强度。

4. 切片出现脱片，如何避免？

答：①载玻片未做防脱处理，可以使用防脱载玻片或对载玻片进行防脱处理。②组织固定不彻底或脱水不充分，重新优化样本前处理方式，如延长固定和脱水时间。③过度热抗原修复处理，采用微波修复温和修复，修复温度控制在 80℃左右或更低，修复液可用2×柠檬酸（PH6.0）。④洗脱液温度过高，降低洗脱液温度或缩短孵育时间。

5. 为什么会串色？

答：①可能与成像设备滤光片带宽有关系，尽量选用窄波长带宽的滤光片；②可能与上一轮抗体未被完全洗脱有关系，对于一些亲和力比较高的抗体比如 CK 等，抗体洗脱条件需要延长（提高洗脱温度和时间等）；③可能与信号不平衡有关系，比如相邻两个通道染料，一个强度过高，一个过低，导致强的信号发生外溢；④其他可能存在的原因，比如抗体弄混，下一轮抗体忘记洗脱或者修复等。

6. 样本为小鼠，是否可以选择小鼠来源的一抗？

答：通常不建议采取这种方式，因为如果一抗来源于小鼠，那么二抗也需使用抗小鼠的二抗，这可能会与样本中本身存在的IgG发生交叉反应，从而导致非特异性结合。若必须使用与样本同种属来源的一抗，建议进行阴性对照实验，即在未添加一抗的情况下，仅加入二抗，以检测是否会产生非特异性信号。

7. 做多标时，指标/抗体顺序如何选择？

答：难以洗脱的抗体，摆在最后一轮，不然容易串色。兔鼠一抗交叉做。比较难做的指标放在前面几轮做。低表达靶标选择荧光强度高、抗淬灭性强的染料，并放在前几轮做。高表达靶标选择荧光强度适中的染料，避免信号饱和掩盖细节。若两种蛋白共表达，建议选择波长差异大的。

8. 传统荧光染色和TSA多重免疫荧光能否搭配使用？

答：可以，但建议将传统荧光染色安排在最后一轮进行。这是由于TSA法在抗体洗脱过程中，会同时洗脱一抗和二抗的结合物。

9. 实验操作过程需要避光吗？染好的片子可以保存多久？

答：Enklife TSA试剂盒的荧光染料具有优异的抗淬灭性能，因此无需在日光灯下进行避光操作，使用过程中也无需在暗环境中进行。不过，请注意避免试剂盒暴露在太阳光下直射。且染色玻片在4℃条件下通常可保存6至12个月。

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