标记试剂盒常见问题解答
1. 小分子染料标记试剂盒可以标记那些类型的抗体或者蛋白
答：常规的不同物种的IgG等都可以进行标记，IgM抗体适当改变染料用量或标记缓冲液也可以进行标记，其他抗体类型如IgY,IgD，IgA等抗体类型未进行过验证，理论上也是可以进行标记的，即抗体或者蛋白上存在游离的伯氨基基团都可以进行标记；
2. 待标记物有没有什么注意事项？
答：待标记物需要有游离伯胺或者N末端，样本中不能含有Tris、甘油、带氨基的蛋白或试剂。
3. 可以小量或者微量标记（例如10ug以下抗体蛋白）吗？
答：目前说明书的方法是用于标记0.02-2 mg的抗体的，如果需要标记的量更小，我们可以提供定制或标记技术服务，后续也会安排小于10ug 量的抗体蛋白标记试剂盒上线。
4. 某某物质(例如叶酸/多肽) 是否能使用标记试剂盒标记FITC/Fluor594？
答：如果某物质上有游离伯胺基理论上就是可以标记的，若是蛋白需要考虑伯胺(赖氨酸)个数，小分子一般根据氨基个数来确定。 叶酸含氮杂环上含有一个氨基，理论上是可以标记上FITC或Fluor594的，但是这个位点的氨基亲核性比较弱，标记效果可能会不太好，另外标记物质的大小需要适配不同的超滤管进行纯化，需要客户根据其实验目的来选择做与否。
5. 如何提高生物素/小分子荧光染料标记效率(DOL)？
答：1）提高染料和蛋白的反应比例；2）提高反应体系中蛋白浓度；3）适当提高反应温度和反应时间；4）改换针对待标记蛋白的标记缓冲液；
6. 标记效率越高，实验效果是否越好？
答：不是，一般而言，对于常规IgG抗体，DOL在2~9之间较为合适，DOL超出此范围，实验效果通常会降低，具体实验效果和待标记的蛋白和抗体特性相关，需要根据实际的实验效果来确定最佳DOL；
7. 小分子染料标记重组蛋白后如何定量及进行浓度测定？
答：重组蛋白定量方法有多种，例如BCA法、紫外吸收法、Bradford、考马斯亮蓝、lowry法等测蛋白浓度，或者根据说明书使用吸光度测定后计算，每一种测定方法都有其测定局限性，客户可以根据实际情况灵活选择测定方案。
8. 生物素标记试剂盒除了标记抗体，可以标记其它蛋白吗？
答：生物素标记试剂盒的原理是活化的生物素的酯键和被标记物上的氨基脱水缩合形成稳定的酰胺键。此外，还可以标记蛋白的N末端。如果蛋白上有伯胺，比如赖氨酸就是可以标记的。
9. 这个生物素标记试剂盒标记蛋白的话，是以20:1的比例反应吗？
答：需要考虑蛋白的分子量及带的赖氨酸数量。一般是建议按照1~5mg/mL的浓度标记，若带的赖氨酸数量在10-15个左右，可以按照1:20的比例。如果数量较多则把比例加大。
10. 如何检测生物素标记抗体的效率？
答：目前我们出售的生物素标记试剂盒是经过了大量抗体的标记比例的优化，如果以标记后抗体回收率计算方式一般标记后抗体回收率80%以上，标记抗体量越大，回收率越高，生物素标记效率的计算方法各厂家标准不一，并非是评价标记效果的决定因素。
11. 溶解后的活化生物素/小分子荧光染料保质期多久？
答：未开封前的活化生物素干粉/小分子荧光染料干粉在-20℃可以稳定保存一年以上，但是开封后/溶解后需要密封好，避光防潮，一周内使用。
12. 标记生物素或者小分子染料的蛋白是否是无菌，如何除菌或者灭菌？
答：标记过程一般是在开放区域进行，因此标记的蛋白不会是完全无菌的。除菌或者灭菌的方法：1）针对小量体积（例如50~500μL）的标记完成后的蛋白，可以采取真空冷冻干燥的方式进行初步灭菌；或者使用高速离心的方式使菌体沉淀，取上清部分，可除去大部分的菌体。2）针对较大体积（大于1ml）的标记完成后的蛋白，可以使用针头式无菌过滤器过滤除菌。
13. 生物素/小分子染料标记蛋白效率如何检测、计算？
答：一般认为标记效率的计算方式有多种理解：
1）DOL：即每个蛋白标记上的染料的平均个数，DOL越大，标记效率越高；
2）DOL和投料比的比值，例如染料和蛋白的投料比为10，最终计算DOL为5则标记效率是50%；
3）抗体回收率：测定定量标记前后抗体的含量分别是多少，标记完成后抗体损失越少，回收率越高，标记效率越高。
14. 标记好的抗体4度条件下可以储存多久？
答：标记好的抗体使用我们的标记保存液保存，可4℃稳定保存半年以上，小分子染料标记的抗体可稳定保存一年以上。
15. 标记的抗体或者蛋白大小有要求吗？
答：上线标记试剂盒中建议标记的抗体或者蛋白是150kDa左右， 如客户需要标记其他大小的蛋白，我们可定制调整提供，但是总体而言建议的蛋白不小于20KD。
16. 有哪些抗体不适合用于标记？
答：不适合包含牛白蛋白血清（BSA），明胶，游离氨基酸(L-组氨酸)或铵盐的抗体或蛋白质。
17. 一般一个抗体上可以结合几个荧光素？不同抗体会不会标记的荧光数量不同？
答：对于同一荧光素而言，相同的标记体系下，不同的抗体标记的荧光数量差别较小，除非抗体的来源差异或缓冲液组分差别较大。一般一个抗体上可标记2~9个荧光分子，DOL＞5以后亮度增加不多，会更亮一些，但背景值可能会增加。对于不易淬灭的荧光可以标记到9，极少数特殊抗体配合的某些荧光素甚至可达10以上或2以下也会有不错的荧光亮度。
18. 标记的效率DOL是如何检测计算的？
答：我们是测纯化后的染料/抗体蛋白的摩尔比，也有用SDS page电泳检测方法或SEC纯化柱来测定的，不同的方法测定结果略有差异，一般情况下区别不是很大。
19. 为什么EnkiLife 标记试剂盒标记后的荧光通常更亮？
答:我们的标记试剂盒中所使用的荧光染料是和多家荧光染料生产厂商合作优化筛选后确定的，且经过了严格的质量检测，同时对部分染料原料进行了化学处理，以保持其稳定性。
20. 小分子荧光染料/生物素和蛋白的比例大概是多少？
答：在抗体浓度是1mg/ml时，摩尔比大约为1：20，不同的荧光染料/生物素会有些差别，但基本是在10：1~30:1之间。
21. 小分子荧光染料/生物素和大分子蛋白荧光染料标记抗体的原理是一样的吗，有什么区别？
答：小分子荧光染料/生物素利用的是SE（琥珀酰亚胺酯NHS）跟抗体的-NH2连接形成类似于肽键的结构，从而连接到抗体上，这是最简便的连接方式；大分子蛋白荧光染料是利用Maleimide活性基团与巯基（-SH）结合，优点是只标记抗体Fc片段不会影响抗原抗体的结合部位。
22. 我的抗体中含有甘油可以用抗体标记试剂盒吗？
答：甘油最好20% 以下，更高含量的甘油可使用超滤管多次超滤换液去除，但对抗体的回收率有一定影响。
23. 我的抗体含有BSA，是否可以使用抗体标记试剂盒？
答：对于大分子蛋白荧光染料标记试剂盒，可以允许含有少量BSA（0.2%以下），对于小分子荧光染料/生物素标记试剂盒，含有BSA对标记结果的影响较大，我们有抗体中BSA去除试剂盒，可除去BSA后进行标记，能得到更好效果。
24. 为什么你们的试剂盒需要那么多的超滤步骤，我看其他厂家的标记步骤都很简单？
答：为保证标记最佳效果，我们的标记试剂盒通常会对抗体原料进行处理，排除杂质对标记的影响，同时标记完成后有部分试剂盒会进行纯化操作，进一步降低未反应的染料对后续检测结果的影响（例如降低背景染色或体内应用等），如果客户的抗体不含干扰标记的因素，且抗体浓度合适，是可以精简一些步骤，标记总花费时间和其他厂家差别不大。
25. 我要标记10mg以上抗体，如何选购标记试剂盒？
答：因大量标记和小量标记工艺上会存在一些差别，我们目前未上线10mg 抗体规格的标记试剂盒产品，如果客户的10mg抗体是同一种抗体，可选10个1mg规格试剂盒或尝试标记技术服务，如果客户的10mg抗体是不同的抗体种类，可结合具体需要标记的荧光类型及标记成本进行考量选择。
 | Hansun Hansun是EnkiLife的蛋白标记专家，精通免疫学、各种标记技术和流式检测，致力于蛋白的精准标记，赋能科技突破。每一个蛋白，都值得被“看见”。 |