CCK-8 实验原理、步骤以及解决方案
CCK-8全称 Cell counting kit-8 试剂，可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。
该试剂中含有水溶性的四唑盐 WST-8[学名:2-(2-甲氧基-4硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐]，它在电子载体 1-甲氧基-5-甲基吩嗉滃硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞中的线粒体脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物(Formazandye)。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。使用酶标仪在 450nm波长处测定OD值，可以间接反映活细胞的数量。
1. 细胞活力检测
2. 细胞毒性检测
3. 细胞增殖检测
4. 药物筛选
实验组:包含细胞，培养基，药物，CCK8
对照组:包含细胞，培养基，CCK8
空白组:包含培养基，CCK8
因最外圈会出现边缘效应,边缘孔的湿度较中间孔低，水分挥发的现象更为严重，96 孔板最外圈不做任何处理加入200μ PBS 或细胞培养液
每个实验组需至少设置3个复合孔。
在 96 孔板上接种100uL 3000-7000/孔的细胞（状态好，汇合度≥80%的细胞），在 37℃、5%CO2、90%湿度条件下继续培养 24-48 h。
注意事项：
a. 具体的细胞数量会根据细胞的大小和增殖速度而定。
b. 细胞铺板时，一定要边混匀细胞边铺板，最好用排枪铺板，减少铺板所用时间，铺板后立即观察铺板密度是否均匀，如果不均匀则标记出密度不均匀孔，弃去该孔。
细胞贴壁后吸出培养基，实验组中加入含药培养基，空白组加入不含药培养基，然后放进培养箱培养。
注意事项：
a. 药物浓度设置：根据药物的IC50来设置浓度梯度以IC50为中心，向高浓度和低浓度各设置一定范围，如果查不到药物的IC50，进行预实验摸索合适范围，预实验可以先进行宽范围初筛，例如设置0.01uM、0.1uM、1uM、10 uM、100 uM(5个浓度)，根据结果缩小合适范围进行正式实验。找到接近药物的最低有效浓度(MIC)和完全抑制浓度(100%抑制)即可。
b. 悬浮细胞可不用吸出培养基，但是要注意药物浓度要正确。
孔内100ul培养基的话加每孔加10uICCK8试剂(CCK8：培养基=1：10)，放进培养箱进行孵育，培养箱孵育1-4h孵育时间越长，OD值越大。
注意事项：
各时间段细胞活力孵育的时间要保持一致!
用酶标仪测定在450nm处的吸光度(间接反映活细胞数量)
注意事项：
若暂时不测的话要终止反应，可将板子置于4度冰箱内，24h内检测如果要测具体细胞数，可以做标准曲线测定OD值在1-2之间可用。
(1)计算细胞存活率的公式如下：
细胞存活率=(实验孔的OD值-空白孔的OD值)/(对照孔的OD值-空白孔的OD值)*100%
(2)计算细胞抑制率的公式如下：
细胞抑制率=(空白孔的OD值-实验孔的OD值)/(空白孔的OD值-对照孔的OD值)*100%
如果要算IC50是算抑制率，因为IC50是指药物抑制某一生物过程50%所需的浓度。反映的是药物“抑制”效果，而非细胞“存活”状态。
1. 问题：细胞接种密度多少合适？
通过预实验确定。通常在96孔板中，每孔接种3000-7000个细胞(根据细胞生长速度调整)，确保终止培养时，对照组细胞孔刚好长满或接近长满(约80-90%汇合度)
2. 问题：细胞状态不好，会影响结果吗？
会极大影响。确保实验使用处于对数生长期、活力高、状态稳定的细胞，传代次数不宜过多。
3. 问题：贴壁细胞实验中出现大量浮起怎么办？
胰酶消化过度(细胞间连接破坏)；培养基血清浓度不足；细胞本身状态差(如复苏后未恢复)。
解决方案：1.胰酶消化时显微镜下观察，待细胞间隙增大、边缘变圆时立即加含血清培养基终止；2.调整培养基血清浓度至10%-15%；3.复苏细胞培养48h，待完全贴壁、伸展后再进行药物处理。
4. 问题：加完CCK8之后，还能继续培养细胞吗？
可以，但需要这些操作过程：小心吸走含CCK8和橙黄色甲臜的培养基(别把细胞吸走!)；用预热 PBS 轻轻冲2-3次，彻底洗掉残留试剂。加入完全培养基，放回培养箱。
5. 问题：药物处理后细胞形态正常但 OD 值低是为什么？
药物抑制细胞代谢酶活性(非细胞死亡)；CCK-8与药物存在竞争抑制;细胞进入休眠期。
解决方案：1.用活死细胞染色(如 Calcein-AMPI)验证细胞活性，排除代谢抑制干扰；2.设“药物+CCK-8+培养基”空白组，扣除药物对显色的影响；3.延长药物处理后的恢复时间(如额外培养 12h)，再检测 OD 值。
6. 问题：细胞接种后出现“空斑”(局部无细胞)。
细胞悬液中存在气泡(加样时带入)；培养板孔底有杂质(未清洗干净)；细胞悬液浓度不均。
解决方案：1.加样前检查细胞悬液，若有气泡用吸头刺破；2.培养板使用前用超纯水冲洗2次，晾干后使用；3.细胞悬液分装前充分混匀，每加10 孔后重新混匀。
7. 问题：细胞死亡率极高，看不到抑制效果怎么办？
降低药物浓度或缩短处理时间；确认是否是溶剂(如DMSO)毒性导致。
8. 问题:细菌或真菌细胞可以用CCK8吗？
解决方案：不能。CCK8的工作原理依赖于真核细胞线粒体内的脱氢酶。
9. 问题：细胞培养到什么程度可以加药？
解决方案：对贴壁细胞接种后需经历“悬浮期(0-6h)→贴壁期(6-12h)一伸展期(12-24h)→增殖期(24h后)”四个阶段，仅当细胞完成贴壁伸展并进入增殖期，才能真实反映药物效应，因此常规场景下，建议接种后 24-48h加药。悬浮细胞无需像贴壁细胞那样等待贴壁适应，接种后若密度适宜，通常12-24h 进入对数生长期(代谢旺盛、增殖稳定，对药物响应灵敏)，因此常规场景下，建议接种后 12-24h 内加药。
10. 问题：CCK8孵育时间多长？
通常1-4小时。需通过预实验确定最佳时间，OD值在1.0-2.0之间线性关系最佳。
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