Western Blot膜再生技术-EnkiLife

WB中膜再生技术 | 专业解决方案

什么是膜再生？

膜再生是从 western 印迹膜中去除一抗和二抗的过程

膜再生是从 western 印迹膜中去除一抗和二抗的过程。其目的是允许在不切割膜的情况下研究同一印迹上的多种蛋白质。

当检查目标蛋白质和合适的上样对照或研究两种分子量相似的蛋白质时，膜再生特别有用。

还有其他情况证明膜再生是有效的解决方案，例如：

通过再生和重新探测单个膜，您可以节省样品和操作时间，无需重新电泳和转印膜。

该方案不适用于膜再生前后的靶标蛋白进行定量比较，因为该操作会从膜中去除一些蛋白。

同样，不应检测再生膜来证明蛋白质的缺失，例如用于敲除检测或 RNAi 实验。

建议使用 PVDF 膜来最大限度地减少样品蛋白的损失，因为硝酸纤维素膜往往具有更明显的蛋白质损失。

两种不同处理强度的再生方案

在下表中，我们提供了了两种不同处理强度的方案。通常建议先尝试温和再生方案，如果来自目标抗体的信号仍然存在，则再进行高强度的再生方案。

可以重复这些步骤以探测多种抗体。但是在每次再生后，电位信号可能会变弱，背景可能会增加。

方案类型	缓冲液配方	实验步骤
温和再生处理	缓冲液，1 L： 15 克甘氨酸 1 克 SDS 10 mL 吐温 20 溶于 800 mL 蒸馏水中将 pH 调节至 2.2 用蒸馏水将体积增加到 1 L	加入缓冲液以完全覆盖膜，室温下孵育 5-10 分钟弃去缓冲液用现配的再生缓冲液再次孵育 5-10 分钟弃去缓冲液在 PBS 中洗涤2次，每次10分钟在 TBST 中洗涤2次，每次5分钟重新封闭膜
剧烈再生处理	缓冲液，100 mL： 20 毫升 SDS 10% 12.5 mL Tris HCl，pH 6.8,0.5 M 67.5 mL 蒸馏水在通风橱下加入 0.8 mL β-巯基乙醇	将缓冲液加热至 50℃ 在有密封盖的孵育盒中加入可以完全覆盖的缓冲液放入膜，在 50℃下孵育45分钟，并适当晃动根据 ß-巯基乙醇基缓冲液的要求处理溶液在水龙头下冲洗膜 1-2 分钟在 TBST 中充分洗涤 5 分钟（微量的 β-巯基乙醇会破坏抗体）重新封闭膜

如何准确评估再生效果

为了确定膜再生效率，应避免使用比色/显色检测试剂，因为它们会在膜上留下永久性的可见污渍，这可能会干扰后续检测。

推荐使用 ECL 发光液，因为它们比比色试剂更灵敏，并且不会留下任何污渍。

测试膜再生效率的最可靠方法是重新封闭膜后直接加入二抗。如果一抗成功去除完全，则不应检测到信号条带。

如果膜干净，应当在下一次一抗孵育之前清洗膜以去除残留的二抗。如果信号仍然出现，则需要升级剧烈再生或重复温和再生过程。

在达到令人满意的再生效率后，应完全去除残留的再生缓冲液，因为再生缓冲液会干扰后续的检测过程。

Zane