Western Blot 实验流程指南
专业蛋白质分析技术完整流程 - 从样本制备到结果检测
样本裂解
细胞和组织样本的裂解液制备
贴壁细胞裂解液制备
- 将细胞培养皿放置冰上并用冰冷的 PBS 洗涤细胞
- 吸出 PBS，加入冰冷的裂解缓冲液（每 10⁷ 个细胞/100 mm 培养皿加 1 mL）
- 用预冷的塑料细胞刮刀将贴壁细胞刮下，转移至预冷离心管
- 4℃ 下持续振摇 30 分钟
- 4°C 下 12,000 rpm 离心 5 分钟
- 吸取上清液转移至预冷的新管中
替代方法： 可用胰蛋白酶消化细胞并用 PBS 洗涤，然后将细胞重悬浮于裂解液中
悬浮细胞裂解液制备
- 将悬浮细胞以 300 g 离心 5 min，弃上清
- 用 10 mL 冰冷的 PBS 重悬细胞，再次离心弃 PBS
- 将细胞重悬到残留 PBS 中，加入冰冷裂解缓冲液（每 10⁷ 个细胞加 1 mL）
- 4℃ 下持续振摇 30 分钟
- 4°C 下 12,000 rpm 离心 5 分钟
- 吸取上清液转移至预冷的新管中
组织裂解液制备
- 用干净器械取出目标组织（冰上操作，避免蛋白酶降解）
- 将组织放入研钵中，倒入液氮"速冻"，立即匀浆
- 加入裂解液，4℃ 下持续振摇 2 小时
- 4℃ 下 12,000 rpm 离心 20 分钟
- 吸取上清液转移至预冷的新管中
浓度要求： 蛋白提取物浓度应保持在 0.1-5 mg/mL，最佳浓度为 1-5 mg/mL
样本制备
蛋白质定量与缓冲液处理
- 取少量裂解液进行蛋白质定量分析，测定每种细胞裂解液的蛋白质浓度
- 确定蛋白质上样量，添加1/4体积的5X样本缓冲液
- 样本还原和变性：将混合后的样本缓冲液在100°C下煮沸5分钟
注意事项： 煮沸后立即置于冰上冷却，防止蛋白质降解
上样和跑胶
SDS-PAGE凝胶电泳
- 将制备好的样本上样至SDS-PAGE凝胶孔中
- 细胞裂解液或组织匀浆总蛋白上样量：20-30 μg
- 纯化蛋白上样量：10-100 ng
- 在100V下跑胶1-2小时（时间电压需优化）
凝胶百分比选择：
| 蛋白分子量 | 分离胶浓度 |
|---|---|
| <15 kDa | 20% |
| 15–40 kDa | 15% |
| 40-100 kDa | 10% |
| >100 kDa | 6-8% |
建议使用还原型凝胶，除非抗体数据表推荐使用非还原性条件
蛋白转膜
从凝胶转移到膜上
- 膜类型选择：硝酸纤维素或PVDF
- PVDF膜使用前需用甲醇活化1分钟
- 用转膜缓冲液冲洗PVDF膜
- 制备转膜层（凝胶与膜紧密接触）
- 按厂商说明优化转膜条件
- 可在封闭前用丽春红染色检查转膜效果
转膜层结构如图所示（从负极到正极）：
重要注意事项： PVDF膜必须全程保持湿润，防止干裂
封闭与抗体孵育
膜处理与抗体结合
- 用封闭缓冲液（5%脱脂牛奶/ BSA）在室温下封闭膜 1 小时或在 4°C 下封闭过夜
- 除去封闭液，用抗体稀释液按照厂商要求稀释一抗
- 建议在 4°C 下过夜或室温2h孵育膜
- 用 TBST 洗涤膜 3 次，每次 5 分钟
- 用抗体稀释液按照厂商要求稀释偶联二抗
- 室温孵育膜 1 小时
- 用 TBST 洗涤膜 3 次，每次 5 分钟
提示： 根据一抗说明书选择合适的封闭液，磷酸化蛋白检测建议使用BSA
ECL检测
化学发光法检测
- ECL工作液配制：等体积混合A液和B液
- 均匀覆盖膜表面，室温避光孵育1分钟
- 吸去多余液体（勿使膜干燥）
- 暗室中X光片曝光（5秒-10分钟）
关键步骤： 根据信号强度调整曝光时间，避免过曝
替代方法： 也可使用化学发光成像系统直接采集图像
试剂配方
常用缓冲液配制方法
| 试剂名称 | 配方 |
|---|---|
| RIPA裂解液 | 50mM Tris-HCl (pH 7.4) 150mM NaCl 1% NP-40 0.5% 脱氧胆酸钠 0.1% SDS 临用前添加： 1×蛋白酶抑制剂 |
| 转膜缓冲液 | 25mM Tris-base 190mM 甘氨酸 20% 甲醇（PVDF膜用） |
| TBST洗涤缓冲液 | 20mM Tris-HCl (pH 7.6) 150mM NaCl 0.1% Tween-20 |
| 5X样本缓冲液 | 250mM Tris-HCl (pH 6.8) 10% SDS 0.5% 溴酚蓝 50% 甘油 5% β-巯基乙醇（还原条件） |
| Zane Zane在生物医药研究领域拥有十年以上的产品经理工作经验，专注试剂、耗材、设备类产品，致力于为客户提供整体解决方案。 |
