文献分享：基于 TSA 信号放大技术对肺结核病变进行多重荧光染色

文献分享：基于 TSA 信号放大技术对肺结核病变进行多重荧光染色

背景

结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）是专一性人类病原体，通过气溶胶传播进入肺泡后，会诱导驻留肺泡巨噬细胞和募集的髓系细胞形成原发性病变，进而发展为具有中央坏死特征的肉芽肿——这是结核病的典型病理标志。Mtb可在肉芽肿内逃避宿主免疫监视，耐受缺氧、低pH和营养匮乏等应激环境存活，因此深入解析病变组织的空间结构、免疫细胞亚群分布及细菌定植特征，对揭示结核病发病机制、评估干预措施有效性至关重要。

传统研究存在两大技术瓶颈：一是常规免疫荧光技术信号灵敏度低、背景噪声高，难以检测低表达抗原；二是多重标记时，不同物种来源抗体的限制导致标记数量有限，且薄组织切片无法实现3D空间结构的完整表征。此外，肺上皮和间充质谱系的结构细胞在Mtb易感微环境形成中的作用尚未被充分阐明，亟需可同时保留组织完整性、内源性荧光报告信号和核染色的高灵敏度成像技术。Lata S等人的研究《Protocol for 3D multiplexed fluorescent imaging of pulmonary TB lesions using Opal-TSA dyes for signal amplification》中建立的优化方案，正是针对上述需求，实现了厚组织切片中多蛋白标记的精准检测与3D重建。

核心方法

TSA技术的核心原理是辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗在过氧化氢存在下，催化荧光标记的酪酰胺转化为活性形式，后者共价结合于靶抗原附近的酪氨酸残基，实现信号的级联放大。研究选用Opal荧光染料作为标记物，相比传统荧光二抗，其信号灵敏度显著提升，且可在低激光功率下成像，减少组织光漂白。

实验周期约3天，核心流程为以Mtb感染的B6.Sst1S小鼠为模型经灌注固定获取肺组织，后续依次完成4%琼脂包埋与振动切片，通过热诱导或Triton X-100处理进行抗原修复并经过氧化氢和抗体稀释液封闭非特异性位点，再经一抗孵育、HRP标记二抗孵育、Opal染料孵育、抗体剥离及洗涤的循环流程完成多重标记后进行核染色，最后使用与免疫染色所用 Opal 染料相匹配的激发和发射光线，通过共聚焦显微镜采集图像并利用Imaris 10.1.0软件完成3D重建。

关键结果

1. 提升信号灵敏度与特异性，降低背景噪声

与传统二抗偶联荧光团的免疫荧光技术相比，Opal-TSA技术的信号灵敏度显著提升。左侧为传统Alexa Fluor 488标记低表达抗原TTF1的成像结果，右侧为Opal 570标记同一抗原的成像结果，二者均采用10×物镜拍摄、相同曝光参数。从图中可清晰观察到，左侧传统技术组仅能捕捉到微弱的弥散荧光，无法明确定位抗原表达部位；右侧Opal-TSA组则呈现出明亮、集中的荧光信号，可精准识别TTF1阳性细胞的分布轮廓。

2. 实现同一物种抗体的多重标记，突破标记数量限制

首先聚焦同一物种抗体的双重标记可行性，以 50μm 厚肺结核病变肺组织切片为样本，通过 “染色 - 剥离 - 再染色” 流程完成验证。用兔源 iNOS 特异性一抗染色，经 HRP 标记二抗与 Opal 690 染料显色；再用 BME/SDS 温和剥离缓冲液去除一抗 / 二抗复合物后，加入另一兔源 TTF1 特异性一抗，搭配 HRP 二抗与 Opal 570 染料二次染色。低倍镜和高倍镜下的单通道与合并图像均显示，iNOS 与 TTF1 的荧光信号边界清晰、无通道渗漏，证明温和剥离方案可彻底去除前一轮抗体复合物，且不影响已共价结合的 Opal 染料信号，直接验证了同一物种抗体双重标记的特异性与可靠性。

进一步拓展至 3 重、4 重标记，所有一抗均为兔源，通过不同光谱的 Opal 染料区分靶标。三种荧光信号分别定位于病变组织的不同细胞群体，无重叠干扰；四种信号精准对应不同细胞类型的表达特征，合并图像中各靶标分布清晰可辨。两组图像均证明，本方案通过优化的剥离与染色循环，可实现至少 4 种同一物种抗体的多重标记，解决了传统技术中 “抗体来源限制标记数量” 的关键瓶颈，为复杂病变组织中多蛋白共定位分析提供了高效工具。

3. 保留组织完整性与内源性信号，支持3D空间结构解析

优化的样本制备和处理流程可完整保留组织完整性、内源性荧光报告信号和核染色，支持3D空间结构解析。

上图聚焦内源性荧光报告系统与 Opal-TSA 多重免疫荧光成像的兼容性，以抗 GFP 抗体染色，结果显示内源性 YFP 报告信号与抗体染色信号完全共定位，证明方案可保留内源性荧光蛋白活性且不干扰抗体检测。抗 TTF1 抗体与细菌报告信号、YFP 信号的合并成像，清晰呈现免疫细胞、细菌与肺上皮细胞的空间分布关系。以无 IFNβ-YFP 报告基因的 B6.Sst1S 小鼠为阴性对照，仅检测到细菌的双荧光信号，无 YFP 非特异性荧光，验证了内源性信号的特异性。

以 50μm 厚肺结核病变肺组织切片为样本，通过 p63 抗体标记靶标，呈现了 2D 共聚焦图像与 3D 重建图像的对比，其中图A为平面 2D 图像，仅能展示靶标在单一平面的分布特征，B为基于该切片 Z-stack 序列经 Imaris 10.1.0 软件重建的 3D 图像，直观呈现了 p63 阳性细胞在病变组织中的三维聚集形态，通过两种成像模式的直接对比，凸显了厚组织切片结合 3D 重建技术的优势，相比 2D 平面成像能更全面、立体地反映病变组织的空间异质性。

4. 传统热诱导抗原修复的替代方法

以 50μm 厚肺结核病变肺组织切片为样本，对比了 2% Triton X-100 室温孵育 1 小时的细胞透化方案与传统热诱导抗原修复（HIER，Tris / 硼酸盐 / EDTA 缓冲液 95℃孵育 30 分钟）方案，通过低倍镜、高倍镜下的 p63 单标成像及 Sox2 与 Krt14 双重标记验证，显示两组均能实现抗原的精准定位与特异性检测，且 Triton X-100 组不仅适配多重标记流程，还可避免 HIER 高温导致的组织脆弱、皱缩问题，证明该温和通透化方案能达到与传统 HIER 相当的检测效果，同时更好保护厚组织完整性，为厚组织切片免疫染色提供了更实用的替代选择。

总结

本文通过系统优化Opal-TSA技术，建立了适用于Mtb感染小鼠厚肺组织切片的3D多重荧光成像方案，核心优势在于高信号灵敏度、同一物种抗体的多重标记能力、组织完整性与内源性信号保留，以及清晰的3D空间结构解析。该方案可精准解析PTB病变中免疫细胞与结构细胞的空间分布关系，以及Mtb在病变中的存活与复制状态，为阐明肺结构细胞在Mtb易感微环境形成中的作用、揭示结核病进展的分子机制提供了关键技术工具。同时，方案的高灵敏度可快速筛选感兴趣区域，提升后续高分辨率成像的效率，加速干预靶点的发现。该技术不仅解决了PTB病变解析的关键技术瓶颈，也为其他疾病的组织空间表征提供了重要参考。

参考文献

Lata S, Yabaji SM, O'Connell AK, Gertje HP, Kirber MT, Crossland NA, Kramnik I. Protocol for 3D multiplexed fluorescent imaging of pulmonary TB lesions using Opal-TSA dyes for signal amplification. STAR Protoc. 2025 Mar 21;6(1):103640. doi: 10.1016/j.xpro.2025.103640. Epub 2025 Feb 20. PMID: 39982826; PMCID: PMC11889971.

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