冰冻样本的免疫组化(IHC)检测
1. 组织OCT包埋
目的：将组织样本用OCT包埋、冷冻，以便后续切片和固定。
材料：
- 组织样本
- 异戊烷
- 干冰
- OCT包埋剂
- 包埋模具
步骤：
准备一个金属容器，将金属容器部分填充异戊烷并置于干冰上，冷却5分钟。
将新鲜组织放入包埋模具中，用OCT包埋剂填充并调整组织方向。
将组织模具放置于装有异戊烷(冷却后)的金属容器上方10-20秒，直至组织块变得不透明，注意避免异戊烷接触OCT。
将冷冻后的组织块存储于-80°C冰箱中备用，若短期保存可放置-20℃冰箱。
2. 切片
目的：将包埋好的组织切成薄片并贴附在载玻片上。
材料：
- OCT包埋的组织样本
- 载玻片
- 冰冻切片机、刀片
步骤：
将OCT包埋的组织样本置于-20°C的冰冻切片机中，平衡温度30min-1h，如果组织样本较大，或样本类型特殊，可适当延长平衡时间至2h。
将冷冻组织块固定在样本支架上。
调整冰冻切片机刀片，确保其牢固并设置合适的切片角度。
修整组织块，暴露组织表面，通常修整厚度为10-30微米。
切片厚度为5-20微米(根据具体实验调整)，丢弃前几片可能有问题的切片。
使用毛刷将切片转移到载玻片上，准备后续固定步骤。
3. 固定
目的：通过固定剂处理，保存组织形态。
材料：
- 组织切片
- 缓冲液(PBS)
- 固定剂(10%中性甲醛、4%多聚甲醛、100%丙酮或甲醇)
步骤：
在切好的冰冻切片放置于室温环境中15分钟。
根据检测目标选择合适的固定剂：
低分子量蛋白质、肽和酶：10%中性甲醛或4%多聚甲醛
大分子蛋白质抗原：100%丙酮或甲醇
大分子蛋白质抗原：100%丙酮或甲醇
将组织切片浸入固定剂中，室温孵育15分钟。
用PBS洗涤切片三次，3min/次。
4. 封闭
目的：通过封闭步骤减少背景染色。
材料：
- 组织切片
- 封闭液(如2-10%正常血清)
- 洗涤缓冲液(PBS)
步骤：
用PBS洗涤载玻片三次，每次3分钟。
进行内源性过氧化物酶封闭，用3%过氧化氢孵育10分钟，用PBS洗涤。
进行蛋白封闭，滴加正常血清封闭液孵育30分钟。
5. 抗体孵育
目的：使用抗体对组织进行染色，可直接使用偶联一抗或间接使用偶联二抗。
材料：
- 抗体稀释缓冲液
- 洗涤缓冲液(PBS)
- 偶联一抗
步骤：
根据抗体说明书确定最佳稀释度，用抗体稀释液稀释抗体。
组织上滴加稀释好的一抗，室温孵育1小时或4°C过夜。
用PBS洗涤切片三次，3min/次。
6. 显色与镜检
目的：通过显色反应观察染色结果。
材料：
- 显色底物(如DAB、AEC)
- 复染剂(可选，如：苏木精)
- 封片剂(可选，如：水溶性封片剂)
- 盖玻片
- 显微镜
步骤：
组织切片上滴加配置好的显色液，显微镜下实时观察，至出现所需阳性信号。
用PBS洗涤切片三次，3min/次。
切片上滴加复染剂溶液，室温孵育2-5分钟。
PBS冲洗载玻片，去除多余染色液并使苏木精变蓝。
在载玻片上滴加少量封片剂。
小心地用镊子将盖玻片放置在切片上，注意避免产生气泡。
使用显微镜观察切片，若不立即观察，可将切片存储于4°C冰箱。
 | Jeff Jeff是EnkiLife的病理产品专家，专注免疫组化检测和产品开发12年+，对用户需求有着极高的洞察力，致力于帮助我们的客户做好免疫组化实验，加速科学发现。 |