抗体标记简介
一、什么是抗体标记？
抗体标记，也称为抗体偶联，是将抗体与特定标签连接的过程。大多数免疫测定需要将一抗抗体直接偶联到特定标签或通过连接的二抗抗体来检测，以提供可测量的信号。
二、为什么要对抗体进行标记？
抗体标记的基本原理旨在解决抗体“不可见性”的问题。由于抗体本身不具备可直接观测的物理信号（如发光或显色），因此必须借助标记物来实现可视化。无论是在进行酶联免疫吸附实验、蛋白质印迹分析，还是荧光成像，以研究肿瘤微环境、分析生物标志物的表型并追踪其动态变化时，都需依赖与各种标记物结合的抗体。这些标记抗体使我们能够可视化并理解蛋白质的结构、功能、定位，以及蛋白质之间的相互作用。
这种可视化将抗体-抗原的特异性结合事件转化为可检测信号：
1）荧光光学信号：荧光素（如FITC）受激发发射荧光；
2）化学发光信号：辣根过氧化物酶（HRP）催化底物（鲁米诺）发光；
3）吸收光颜色信号：辣根过氧化物酶（HRP）催化底物（TMB）显色；
4）质谱信号：铟金属标签用于质谱流式（CyTOF）；
三、 抗体标记的种类
1、一抗和二抗
按照抗体的应用及检测原理，抗体可分为一抗和二抗， 对应于免疫检测的直接检测法和间接检测法。
分类 | 定义 | 生物学本质 |
一抗 | 直接特异性结合目标抗原（如蛋白、多糖、病原体）的抗体 | 抗原驱动产生：由宿主动物（小鼠、兔等）免疫后B细胞克隆分泌 |
二抗 | 针对一抗的恒定区（Fc段）设计的抗体，通过结合一抗实现信号放大或转换 | 抗体驱动产生：由免疫一抗宿主种属的IgG类型诱导生成 |
对抗体进行标记时，不同的标签结合于抗体的特定氨基酸种类或抗体的特定化学结构，如果一抗和二抗的分子量大小和化学结构比较接近时，对一抗和二抗的标记不会有本质上的差别。
举例：检测人CD4蛋白时：
一抗：抗人CD4单抗（小鼠源IgG 型抗体），可结合human CD4抗原
二抗：选择山羊抗小鼠IgG，可结合小鼠源一抗的Fc段
2、抗体种类亚型
对于胎生哺乳类动物，按照抗体的结构和组成划分（重链恒定区结构），抗体可分为IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM，其中前面的"Ig"代表免疫球蛋白（Immunoglobulin，对抗体的另一种称法）。对于其他类型的动物，例如鱼类，禽类，抗体的种类又会有所不同，例如斑马鱼含IgZ抗体，鸡含IgY抗体，不同抗体类型在生物体中的属性、发挥功能的位置以及所能处理的抗原类型均有所不同。了解所使用的抗体种类，对于获得正确的实验结果及分析处理问题比较重要。使用标记试剂盒标记不同种类的抗体时，需要进行一定程度的优化。
举例：检测mouse CD45R蛋白时：
一抗：抗mouse CD45R蛋白（rat 源IgM型抗体），可结合mouse CD45R抗原
二抗：选择使用山羊抗大鼠IgM，可结合大鼠源一抗的Fc段
或者
一抗：抗mouse CD45R蛋白（rabbit 源IgG型抗体），可结合mouse CD45R抗原
二抗：选择使用山羊抗rabbit IgG，可结合兔源一抗的Fc段
人、鼠抗体的5个种类
对于抗体IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM等类型抗体，根据铰链区的大小，链间二硫键的位置和分子量的不同，人和鼠的IgG可以进一步细分为四种亚型。人的IgG可以分为IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，小鼠的IgG可以分为IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，根据这种细分类型，可以针对性生产出相对特异性的二抗，可以拓展二抗的应用及实验的准确性。
人IgG抗体的4种亚型
3、抗体克隆性
另一种对抗体进行分类的方法是依据其多克隆或单克隆的特性；两者之间的主要区别在于产生它们的 B 细胞来源。多克隆抗体由混合的或异质 B 细胞群产生，这意味着同一管多克隆抗体实际上包含多种不同的抗体。如果多克隆抗体具有高度选择性，那么该混合物中的抗体将会与靶标蛋白内部的多个表位结合。相反，单克隆抗体由相同的 B 细胞克隆产生，因此一管纯化的单克隆抗体将包含相同的抗体拷贝，并且应当仅结合于单一表位。最重要的是，如果条件允许，单克隆抗体相较于多克隆抗体能够提供更稳定和一致的性能表现。
单克隆抗体特异性识别单一表位，多克隆抗体识别同一蛋白的多个表位
由于多克隆抗体和单克隆抗体通常是同一种抗体类型，差别在于抗体可变区氨基酸种类，因此对于相同的抗原蛋白的同一种抗体亚型的多克隆抗体和单克隆的标记，标记方法几乎没有差别。
4、重组抗体
另一种抗体的分类方式是基于其生产方法，即分为重组抗体生产和传统方式生产。重组抗体的一个显著特点是其基因和肽序列为开发者所熟知，这使得科学家能够在细胞培养中表达抗体以实现放大生产。重组单克隆抗体生产通常是许多研究应用的首选，因为它能够提供持续的抗体供应，并且对于最终用户而言，它具有更高的批间一致性和可靠性。在标记重组抗体时，需要明确其基本的氨基酸序列组成和结构信息，以及抗体分子量的大小。例如，某些重组抗体可能只是传统抗体结构的一部分，或者融合了某些特殊的氨基酸或生物分子标签，此时应采用针对性的标记化学方法进行标记。
四、标记抗体的免疫学应用
常见的免疫检测技术及其相关标签
免疫检测技术 | 标签 |
流式细胞术(FC) | 藻红蛋白 (PE)，别藻蓝蛋白 (APC)，或串联染料，Fluor 488等 |
免疫细胞化学和免疫荧光(ICC/IF) | 荧光染料，HRP |
免疫组化(IHC) | 酶（HRP或AP），生物素 |
蛋白质印迹法(WB) | 酶（HRP或AP），荧光染料 |
酶联免疫吸附测定 (ELISA) | 酶（辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP），生物素 |
不同免疫检测技术使用的标签类型并非是严格唯一确定的，例如Fluor 488 荧光染料，也可以标记应用于免疫荧光的抗体，或者应用于蛋白印迹的抗体，或者荧光法酶联免疫吸附测定的抗体。
五、抗体如何标记？
传统的共价偶联技术，如NHS酯法或使用双功能化学试剂的间接标记法，通常涉及将标签偶联到赖氨酸残基上。这类标记方案不仅需要丰富的化学知识，还要求具备分离技术的经验，以有效去除多余的标签或低分子量活化试剂。此外，对抗体的生产工艺和原料控制有深入了解，也是影响标记效果的关键因素。
相比之下，使用EnkiLife的标记试剂盒则更加简便快捷。用户只需按照试剂盒提供的操作步骤进行，即可轻松获得所需的标记抗体。无需深入学习或反复摸索标记化学的原理和操作，这些试剂盒能够帮助您避开化学偶联过程中常见的难题，从而大幅节省实验测试时间。
 | Hansun Hansun是EnkiLife的蛋白标记专家，精通免疫学、各种标记技术和流式检测，致力于蛋白的精准标记，赋能科技突破。每一个蛋白，都值得被“看见”。 |