标记用Cy花菁荧光染料简介

一、初识CY 染料

CY 为花菁 (Cyanine) 的缩写，是含有两个氮原子之间多次甲基桥链且带有分散电荷的分子。虽然Cyanine在词源上源自蓝色的色调，但Cyanine家族涵盖了电磁谱从近红外到紫外线区域的多种染料类型。经典的菁染料含有两个含氮杂环，分子内部含有由碳氢(CH)n 组成的共轭链，n 可为奇数或偶数。由于其结构，染料具有极高的消光系数，通常超过100000 L/(mol*cm)。分子内部不同的取代基可以控制花菁色素的特性，如吸收波长、光稳定性及荧光。例如，吸收波长和荧光波长可以通过选择聚合亚乙烯基单元的长度来控制：较长的花菁染料具有更高的吸收和发射波长，可达近红外区域 (如图1所示)。根据链中的碳原子数，花菁染料被分为一甲川基 (CY1，n=0)、三甲川基 (CY3，n=1)、五甲川基 (CY5，n=2) 和七甲川基 (CY7，n=3)。除细胞显影外，它们也常用于生物筛选，蛋白免疫印迹，生物医学显影，小动物体内成像等。

花菁染料基本结构模式

图1不同花菁类染料的结构式举例说明 

另外一种分类方式可根据两个吲哚啉基团之间的碳原子数量来划分，即Cy代表“花菁染料”，CY3即代表两个吲哚啉基团之间有三个碳原子，CY5代表两个吲哚啉基团之间有5个碳原子，依此类推（如图2所示），但是CY2染料是个例外（如图3所示），它是一个氧杂衍生物而不是吲哚啉，但是氧杂衍生物之间含有三个碳原子，这一点需要和CY3进行区分。

图2  CY3、CY5、CY7结构式

图3  CY2、CY3结构式对比

对于Cy3.5，Cy5.5，Cy7.5等染料，和CY3，Cy5，Cy7的区别在于将吲哚啉基团替换成为了含苯并基的结构形式(如图4所示）。结构的变化可以改变分子的荧光特性，如此即可用几种荧光团覆盖可见光和近红外光谱的大部分波谱范围（如图5所示）。

图4  CY3/CY3.5、CY5/CY5.5、CY7/CY7.5结构式对比

图5常用花菁染料光谱

二、CY 染料的历史发展

花菁染料在一百多年前首次合成。它们最初被使用，是为了增加摄影乳剂的敏感范围，即增加能够形成图像的波长范围，使胶片成像色感更丰富，因此也被用于CD-R和DVD-R介质中。所使用的类型主要是绿色或淡蓝色染料，但化学不稳定。最近的花菁染料包含稳定剂，通常是与花菁染料分子结合的金属原子，显著减缓了退化，提高了染料的稳定性。这些光盘的档案寿命通常为75年或更长。

20世纪90年代初，由CMU的Alan Waggoner及其同事引入了生命科学中最受欢迎的品红染料。这些染料是对自1970年代以来用于血管造影的品红染料Indocyanine Green (ICG)进行了修饰，都包含两个吲哚烯环夹持着多亚甲基链。这些染料被发现对生物分子的非特异性结合低，且由于其巨大的消光系数和良好的量子产率而具有明亮的荧光。

Cy3、Cy5等命名由Ernst等人于1989年首次提出，由于它没有给出其化学结构的任何提示，因此是非标准的。在最初的论文中，编号表示 亚甲基的个数（如图1所示），侧链则未作指定。由于这种歧义，文献中对Cy3和Cy5的各种结构都有所指。 R基团不一定要相同。在所使用的染料中，它们是短脂族链，一端或两端具有高度反应性的基团，如N-羟基琥珀酰亚胺或亚甲基羧酸。尽管标准Cy系列染料的专利保护已经到期，但Cy命名的商标仍然存在。因此，现在销售的与Cy染料相同但名称不同的染料已经出现，或是和Cy染料名称相同但是结构不同的染料也有存在（如图7所示）。

许多标准 Cy2 / 3 / 3.5 / 5 / 5.5 / 7 / 7.5 染料的类似物已经被开发出来，使用了多种修饰方法：如Alexa Fluor 染料，Dylight染料，FluoProbes 染料，Sulfo Cy 染料，Seta 染料，IRIS 染料等，这些染料在大多数生化应用中可以与 Cy 染料互换使用，并且在溶解性、荧光或光稳定性上有改进（如图6所示）。这些优化后的部分染料的结构式因专利到期被公布，部分染料因专利保密原因其结构式未知。

图6花菁染料演化发展图（图示具有相同的主链结构，侧链进行了优化改进） 

表1 三种近似染料的荧光特性

图7 几种近似染料的结构演化发展对比（举例：相同名称都是Sulfo Cyanine7 NHS 的染料，但是分子化学结构有一定差别）

图8  三种近似染料FITC、Rhodamine、Alexa Fluor488结构式对比 

表2 几种荧光染料的光学特性对比

三、磺化CY染料和非磺化CY染料

CY 染料分为非磺化花菁染料和磺化花菁染料，两者表现出非常相似的荧光特性（如图9所示）。然而，在标记方案上有一些需要注意到的差异:

1、非磺化花菁染料在使用前必须溶解在有机溶剂（DMF 或 DMSO）中，并加入到目标分子的水基缓冲溶液中。推荐的共溶剂体积为：Cy3、Cy5、Cy7 为 10%，CY3.5、CY5.5、Cy7.5对应物为 15%。磺化染料包含额外的磺酸基团，有助于染料分子在水相中溶解。带负电的磺酸基团减少了染料分子在高度标记时共轭物的聚集，且负电荷可以减少与非靶标带正电生物分子（如某些膜表面蛋白）的非特异性结合。

2、纯化差异：当使用水基缓冲溶液进行透析纯化时，必须使用磺化花菁染料以实现对未反应的染料材料的有效去除。磺化和非磺化花菁染料的反应可以通过凝胶过滤、色谱（HPLC、FPLC、离子交换）或电泳进行纯化。

3、在 DNA 和蛋白质的标记中，它们是可互换的，两种均可用于标记生物分子。磺化花菁染料具水溶性，且不易在水中聚集，是抗体和蛋白标记的首选。非磺化花菁染料的荧光特性对溶剂和周围环境的依赖性较小。

图9 磺化和非磺化的花菁染料光谱

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四、花青素（Anthocyanins）与花氰素（Cyanine）的对比解析

日常生活中，我们经常还会听说另外一种花青素染料，且中文名称和用作荧光标记显影的花氰素（Cyanine）名称经常混用，为了区分两种，现对其进行进一步的说明。

1、基本定义与来源

2、显色机制与稳定性

显色原理：

花青素：依赖pH变化，通过分子内质子转移改变共轭结构（如酸性变红，碱性变蓝）。

花氰素：因聚甲炔链的π电子离域显色，吸收波长长（近红外区），颜色受取代基和溶剂影响。

稳定性：

花青素易被光、热、金属离子破坏（需低温避光保存）。

花氰素稳定性高，但部分衍生物（如CY5）易光漂白，需加入抗淬灭剂。

3、应用领域对比

4. 安全性与环境影响

花青素：

安全性高，可食用且无毒性；

生物降解性强，环境友好。

花氰素：

实验级染料可能对水生生物有毒（需遵守某些法规）。

5、常见误区与关联性

名称混淆：因中文音译相近（“青”与“氰”），但两者无化学关联。

功能交叉：

花青素偶用于简易pH试纸（天然替代品）；

花氰素衍生物（如Indocyanine Green）可用于医学造影，与花青素的生物活性无关。

6、总结

花青素与花氰素本质迥异：前者是植物进化出的天然抗氧化色素，后者是人类合成的功能性染料。理解其差异有助于避免应用混淆（如食品禁止添加合成菁染料），同时在生物医学和工业领域精准选择材料。

参考文献：

1.H.A.Shindy.Fundamentals in the chemistry of cyanine dyes: A review. Dyes and Pigments.Volume 145, October 2017, Pages 505-513

2. G.S. Gopika, P.M. Hari Prasad.Chemistry of cyanine dyes-A review.Materials Today: Proceedings,2020, 2214-7853

3. Aria Vahdani,Mehdi Moemeni, Daniel Holmes,. Mechanistic Insight into the Thermal “Blueing” of Cyanine Dyes.J. Am. Chem. Soc. 2024, 146, 19756−19767

4. Elliot. Inhibition of glutathione reductase by flavonoids. A structure-activity study.Biochem Pharmacol 1992;44(8): 1603-8.

5. Igarashi K, et al. Preventive effects of dietary cabbage acylated anthocyanins on paraquat-induced oxidative stress in rats. Biosci Biotechnol Biochem 2000 Aug;64(8):1600-7.

6.杨松杰, 田禾. 菁染料光稳定性研究进展[J]. 影像科学与光化学, 1999, 17(3):275-283.

Hansun  Hansun是EnkiLife的蛋白标记专家，精通免疫学、各种标记技术和流式检测，致力于蛋白的精准标记，赋能科技突破。每一个蛋白，都值得被“看见”。