文献分享：多重免疫荧光在肿瘤三级淋巴结构研究中的应用

文献分享：多重免疫荧光在肿瘤三级淋巴结构研究中的应用

背景

三级淋巴结构（TLSs）是一种异位淋巴集合体，可在肿瘤内部或邻近发育，激活抗肿瘤免疫，其成熟状态与患者免疫疗效及生存期密切相关，是极具潜力的预后标志物。但TLSs研究长期受困于技术瓶颈：一是传统单标免疫组化无法区分功能性TLSs与普通免疫聚集，误判率高。二是缺乏多维度标志物同步评估，难以建立成熟度分级标准。三是临床前小鼠模型与患者样本的检测技术不兼容，阻碍转化研究。

Opal-TSA多重免疫荧光（mIF）技术凭借高敏感性与染色灵活性，成为突破上述瓶颈的理想选择。文献《Protocol for investigating tertiary lymphoid structures in human and murine fixed tissue sections using Opal-TSA multiplex immunohistochemistry》以Opal-TSA多重免疫荧光技术为核心，构建了一套针对人及小鼠肿瘤组织中TLSs的标准化研究方案。TLSs作为肿瘤微环境中关键的异位淋巴样聚集结构，其精准识别与功能表征对肿瘤免疫研究至关重要，而该文献通过mIF技术的创新性应用，为解决TLSs研究中的技术瓶颈提供了可靠路径。

实验设计

为判断TLSs的成熟度，筛选兼具特异性与互补性的标志物组合，作者选用抗体CD4, CD8, CD19, CD21, DC-LAMP， PNAd和DAPI对人福尔马林固定石蜡包埋组织切片进行七色标记的TLSs检测，在小鼠组织切片中，去除DC-LAMP抗体，进行六色标记的TLSs检测。既覆盖TLSs核心细胞组成，又可通过标志物共定位区分TLSs与普通免疫细胞聚集。荧光基团的匹配遵循低丰度抗原配高亮度荧光原则，对于表达量较低的低丰度标记选择荧光亮度更高的荧光团进行配对，如 Opal™620 或 Opal™520，而对于表达量较高的高丰度标记，选择荧光亮度相对较暗的荧光团，如 Opal™690。之后通过热应激试验确定染色顺序。用优化后的一抗条件，对 6 张连续阳性对照切片分别进行 1-6 轮热诱导抗原修复 （HIER） 处理后染色，固定曝光时间下观察切片染色强度差异，对 HIER 敏感的标志物优先检测，对 HIER 耐受的标志物后续检测。洗脱抗体时使用50℃低pH甘氨酸缓冲液，确保前一轮抗体完全去除且不影响已结合荧光信号。染色完成后采用Vectra自动化定量病理成像系统开展全景扫描与多光谱成像，结合Phenochart、inForm及HALO软件完成图像光谱解混、细胞表型分析与定量统计。

多标志物共定位

通过七标Opal-TSA技术对具有代表性的人淋巴结FFPE组织切片进行多重染色，无论是手工染色还是自动染色均成功地识别和表征了FFPE组织切片上的免疫细胞聚集体和TLSs。

构建人源肿瘤组织TLSs成熟度分级系统

为构建TLSs成熟度分级系统，文章设计了同组织不同区域TLSs分级对比图，选取人前列腺癌FFPE组织切片4个典型区域，包括免疫细胞浸润（Grade 0），免疫细胞聚集（Grade 1），不成熟的TLS（Grade 2）和成熟的TLS（Grade 3）。通过统一的标志物染色与成像参数，实现分级标准的直观量化。

使用提出的TLSs分级系统，通过人工染色在黑色素瘤FFPE组织切片中成功识别出2级和3级TLS。且在人前列腺癌FFPE组织切片中成功实现自动染色。证明构建的TLSs成熟度分级系统能够实现人FFPE肿瘤组织切片对免疫细胞聚集体、未成熟TLSs和成熟TLSs进行鉴定和分级。

跨物种图像验证TLSs成熟度分级系统

为验证方案的跨物种适配性，文中同步呈现了小鼠胃癌组织切片的mIF图像，采用六色标记的Opal-TSA。图像结果显示准确识别和分类了小鼠组织切片中TLSs的成熟度，包括免疫细胞浸润，免疫细胞聚集，不成熟的TLS及成熟的TLS。同样，2级和3级TLS也可以通过人工染色在小鼠胃癌组织切片中成功鉴定出来。

跨物种图像的价值不仅在于验证技术普适性，更在于为“临床前小鼠模型-临床患者样本”的关联研究搭建了桥梁，使小鼠模型中TLSs调控机制的研究结果可通过图像特征类比，初步预测其在人体中的应用前景，加速基础研究向临床转化的进程。

总结

作者通过多重免疫荧光图像的创新性应用，将mIF技术从单纯的染色方法升级为图像驱动的研究工具。构建了基于 Opal-TSA多重免疫组化技术的实验方案，该方案可在人源及鼠源组织切片中对 TLSs 进行原位检测与表征，支持同时检测多达 6 种抗原标志物，并配套提供了用于区分未成熟与成熟 TLSs 的分级系统，为 TLSs 解析肿瘤免疫微环境和评估免疫治疗疗效，提供了从检测到结果解读的完整技术流程。

参考文献

Quigley LT, Pang L, Tavancheh E, Ernst M, Behren A, Huynh J, Da Gama Duarte J. Protocol for investigating tertiary lymphoid structures in human and murine fixed tissue sections using Opal™-TSA multiplex immunohistochemistry. STAR Protoc. 2023 Mar 17;4(1):101961. doi: 10.1016/j.xpro.2022.101961. Epub 2023 Jan 10. PMID: 36633948; PMCID: PMC9843255.

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