Western Blot (WB)技术手册
Western Blot（WB）又称蛋白免疫印迹，用于从复杂混合物中分离和鉴别特定蛋白，广泛采用的基础蛋白分析手段。
1. 技术原理
与 Southern或 Northern杂交方法类似，但 Western blot采用的是SDS‑PAGE，被检测物是蛋白质，「探针」是抗体，「显色」用标记的二抗。先经过 SDS‑PAGE分离蛋白质样品，由于凝胶不利于抗体与其中的蛋白质结合，所以需要将蛋白质转移到固相载体 (例如PVDF膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的一抗起免疫反应，再与酶或同位素标记的二抗反应，经过底物显色或荧光成像等方法以检测电泳分离的蛋白质，由此对目的蛋白进行定性和半定量分析。
2. 实验方案概述
以下是WB实验流程概述。详细说明请参阅完整技术手册。
第 1 阶段‑样品制备
- 提取总蛋白：分离后的目标样本，使用裂解缓冲液处理细胞器、细胞或组织样本，并通过机械搅拌释放蛋白质。
- 测量蛋白质浓度：这一步可以确保蛋白质的上样量充足，并且样本的上样量一致。
- 还原和变性：样本通常还要用上样缓冲液进行处理，95 ℃水浴或金属浴加热10 min，使蛋白充分变性，‑20 ℃保存备用。
第 2 阶段‑上样和跑胶
- 根据目标蛋白质分子量大小选择合适的 PAGE凝胶以及对应的电泳缓冲液，将变性后的蛋白样本等量加入凝胶中，实际电泳时间以溴酚蓝到达凝胶底端或预染 Marker分离充分为准。
第 3 阶段‑蛋白转膜(以湿转为例）
- 将海绵垫‑滤纸（可选）‑胶‑印迹膜‑滤纸（可选）‑海绵垫的方式紧密排列，浸没在含有转膜缓冲液的电泳槽里，转膜时间可能因仪器、转膜缓冲液以及目标蛋白分子量大小而不同。
第 4 阶段‑封闭和抗体孵育
- 封闭：室温孵育 1‑2 h。
- 一抗孵育：4 ℃过夜孵育，或室温孵育 2 h。
- 二抗孵育：室温孵育 1‑2 h。
第 5 阶段‑显影
- 孵育完成后，即可对印迹膜进行成像。
2h极速WB vs 1‑2天传统WB
Western Blot (WB) 作为免疫学核心实验，常因流程复杂、结果不稳定成为科研痛点。EnkiLife全新推出的2h极速WB即用型全流程试剂盒，不仅将实验时间缩短至2小时，更通过创新设计确保结果高度可重复。
| 操作内容 | 传统WB | 2h极速WB试剂盒 | 时间节省 |
|---|---|---|---|
| 总时长 | 1‑2天 | 约2小时 | 90%以上 |
| 电泳 | 90 min | 25 min | 50% |
| 转膜 | 90 min | 25 min | 72% |
| 封闭时间 | 60 min/过夜 | 0 min(可不封闭) | 100% |
| 一抗孵育 | 120 min/过夜 | 20 min | 88% |
| 二抗孵育 | 60 min | 20 min | 66% |
| 洗涤与显色 | 60 min | 10 min | 83% |
3. WB异常结果分析
针对高背景、无信号或条带弱、出现多条带等WB常见问题进行分析。更多WB技术答疑请参阅完整技术手册。
| 问题 | 可能的原因 | 解决方案 |
|---|---|---|
| 高背景 | 抗体浓度过高； 封闭不充分； 洗涤不充分。 | 降低一抗 / 二抗浓度； 优化封闭时间； 增加漂洗次数与洗涤缓冲液用量。 |
| Marker和目的蛋白均无信号或条带弱 | 实验流程问题； 转膜时间不合适； 化学发光底物信号弱。 | 检查转膜方向； 大分子增加转膜时间，小分子缩短转膜时间； 延长曝光时间。 |
| 目的蛋白无信号或条带弱 | 一抗浓度过低； 目的蛋白不存在； 蛋白上样量不足。 | 提高一抗浓度和/或延长孵育时间； 确定样本中是否存在目的蛋白； 适当增加上样量。 |
| 出现多条带 | 蛋白质降解； 蛋白质被切割； 蛋白质形成多聚体； 存在非特异性条带。 | 添加新鲜的蛋白酶抑制剂； 查看文献，了解切割位点的位置； 2/3 倍分子量条带考虑多聚体； 更换特异性高的抗体。 |
| 条带返白 | 一抗、二抗浓度过高； 底物敏感度过高； 上样量过大。 | 降低抗体浓度； 更换为温和型/低敏型 ECL 底物； 减少蛋白上样量。 |
4. 详细技术手册
如需获取完整的实验方案、不同样本裂解指南、内参或二抗选择指南以及WB技术答疑，请下载完整的Western Blot (WB)技术手册。
下载完整手册 (PDF, 1.8 MB)内容基于EnkiLife Western Blot (WB)技术手册（2026.9.23）。