近年来，多重免疫荧光（Multiplex Immunohistochemistry，mIHC）凭借其多标志物同步检测和空间信息分析能力，已成为肿瘤微环境研究、免疫治疗评估和空间病理学研究的重要工具。然而，与传统IHC相比，mIHC实验流程更加复杂。从抗体筛选到Panel设计，再到TSA染色和图像分析，每一个环节都可能影响最终结果。
传统IHC是病理学和组织学研究的重要基础技术，在临床诊断和常规科研中仍具有不可替代的价值。而mIHC则是在IHC基础上的进一步发展，通过多标志物同步检测和空间分析能力，为肿瘤微环境研究、免疫治疗研究和空间生物学研究提供了更丰富的信息。
TSA试剂盒不仅能够实现数十倍甚至更高的信号放大，还可在多轮染色过程中保留稳定荧光信号，因此支持同一组织切片上进行2-6重甚至更高通量的多指标检测，并有效降低同种属抗体交叉反应带来的限制。
不同于传统免疫荧光、普通免疫组化的检测模式，TSA技术依托辣根过氧化物酶（HRP）的高效酶促催化反应，可驱动荧光标记酪胺分子在靶标位点特异性沉积，实现信号数十倍放大，完美解决了低丰度蛋白难检出、弱信号易丢失的痛点。同时，该技术可通过多轮循环染色与信号淬灭，在单张组织切片上完成多色靶标同步标记，完整保留组织原位空间结构与细胞互作信息，为病理样本的多维、深度解析提供了可靠技术支撑。
mIHC全称为多重荧光免疫组化技术（Multiplex Immunohistochemistry），是在传统免疫组化（IHC）基础上迭代升级的高通量、高空间分辨率病理检测技术。该技术可在同一张组织切片样本上，同时检测多个蛋白标志物（Marker）的表达水平、定位分布及共表达关系，能够完整保留组织微环境的空间结构信息，精准解析细胞异质性、细胞间相互作用以及组织原位的蛋白表达特征，广泛应用于肿瘤免疫、靶向药物研发、疾病机制研究、临床病理诊断等领域。
作者创新性地运用多重荧光免疫组化技术（mIHC），以84例结直肠癌患者的癌组织及癌旁正常组织为研究对象，构建肿瘤组织芯片（TMA），同步检测癌干细胞标志物CD133、免疫检查点分子PD-L1、肿瘤相关抗原HER2及巨噬细胞标志物CD68的表达水平，结合临床病理特征与7年随访数据，探究上述标志物在结直肠癌中的诊断及预后价值，为结直肠癌的精准诊疗提供了新的技术支撑与理论依据。
肿瘤微环境的精准解析是癌症诊断、预后评估及治疗决策的核心基础，而传统组织成像技术存在明显局限：单一免疫荧光（IF）成像虽能检测多分子标志物，但缺乏组织形态学背景支撑，难以准确定位细胞类型及分布。苏木精-伊红（H&E）染色作为病理诊断金标准，可清晰呈现组织形态，却无法提供分子水平的免疫特征信息。现有多重成像技术要么流程复杂、耗时较长，要么存在荧光串扰、试剂稳定性不足等问题，难以实现分子标志物+组织形态的同步精准检测。
肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）数量增多与多种人类癌症的良好临床预后密切相关，该细胞最初由病理学家在苏木精 - 伊红（H&E）染色切片中识别界定，其分布位置与数量更是黑色素瘤的重要预后指标。
随着肿瘤免疫治疗的快速发展，精准评估肿瘤免疫微环境（TME）成为解读免疫逃逸机制、筛选免疫治疗获益人群、优化治疗方案的核心前提。传统单标免疫组织化学（IHC）和免疫荧光（IF）技术仅能检测单一标志物，无法全面呈现TME中复杂的免疫细胞亚群组成、标志物共表达特征及细胞间空间关系，难以满足精准免疫治疗研究与临床应用的需求。在此背景下，多重免疫组织化学（mIHC）和多重免疫荧光（mIF）技术应运而生并快速迭代，凭借可同时检测组织切片中多种标志物的优势，成为解析TME异质性、挖掘免疫治疗生物标志物的核心技术。
肿瘤微环境（TME）的免疫特征与癌症预后及免疫治疗应答密切相关，mIHC/mIF技术可量化免疫细胞亚群、功能状态及空间分布，但其应用存在平台差异大、操作不规范等问题。为此，SITC召集多领域专家，梳理了mIHC/mIF各类技术的原理、流程、优劣，制定了抗体选择、实验优化、验证等环节的共识性建议，同时指出该技术有望进入常规临床应用，为其规范化发展及生物标志物研究提供了重要参考。
